一种基于恒力模式下单分子力谱测量的核酸检测方法

本发明涉及核酸检测，尤其是涉及一种基于恒力模式下单分子力谱测量的核酸检测方法。

背景技术：

1、核酸检测是一种重要的生物技术手段，除了在生命科学以及医学研究领域有着广泛的应用，在公共卫生安全、食品安全、生物安全等多个方面也发挥着极为重要的作用。目前常规的核酸检测包括基因测序和荧光定量pcr(qpcr)。由于这两种方法需要聚合酶扩增，因而不适合用于短片段的核酸检测。

2、单分子技术是近年发展的一种可以检测和操纵单个分子的技术，单分子技术的出现为高灵敏度、高特异性的短片段核酸检测提供了一类新的方法，单分子技术包括单分子荧光显微镜和单分子力谱等。目前，已有研究采用单分子荧光显微镜检测mirna，其方法是将mirna固定在玻片表面，随后加入能与mirna结合的荧光探针，利用单分子荧光显微镜检测荧光探针结合的动力学过程，可以判断待测mirna的检出，虽然该方法灵敏度高，特异性好，但是该方法需要单分子荧光显微镜等昂贵的仪器，以及荧光信号受光漂白的影响，未被广泛使用；对于单分子力谱，其主要是通过施加力来实时操纵感兴趣的分子，被广泛应用于研究核酸、蛋白等生物大分子，常用的单分子力谱技术有光镊、磁镊、原子力显微镜等，其中磁镊相比于其他单分子力谱技术，有高通量追踪多个分子，且能长时间观测稳定等优势，已被研究者用于核酸分析。相关技术表明，使用力诱导的链侵入可以形成发夹探针，而该探针可用于核酸分析，其具体过程是待测核酸结合探针后，将力降至特定力，计算该力下待测核酸解离前和解离后探针的伸长量的变化，从而确定待测核酸是否结合。然而，仅根据伸长量的变化较难识别核苷酸否含有错配，即可能出现假阳性检测结果。因此，需要寻求一种核酸检测方法，其能够识别碱基错配，且能达到单碱基的特异性。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于恒力模式下单分子力谱测量的核酸检测方法，该方法可以识别碱基错配，并且能达到单碱基的特异性，较好地解决了核酸检测过程中相似序列的核酸带来的假阳性的问题。

2、本发明的一种基于恒力模式下单分子力谱测量的核酸检测方法，包括：

3、将t型发夹探针与待测核苷酸混合，并对t型发夹探针施加恒定力，通过测量所述t型发夹探针结合所述待测核苷酸后的伸长量变化值计算结合碱基数，和/或通过比较无错配核苷酸和所述待测核苷酸分别与所述t型发夹探针的解离速率常数判断是否存在碱基错配。

4、根据本发明实施例的方法，至少具有如下有益效果：本发明检测核酸是通过直接在一恒定力下观测目标核酸结合导致的探针伸长量变化这一过程，该方法可以识别对碱基错配进行识别，并且该方法能达到单碱基的特异性识别，较好地解决了核酸检测过程中相似序列的核酸带来的假阳性的问题。

5、此外，本发明提供的基于恒力模式下单分子力谱测量的核酸检测方法，可以实现快速、无需扩增，无需蛋白参与、无需对待测物进行标记、适用于短序列的核酸检测，能够估计待测核酸与探针结合的碱基数，并且该方法可以实现高特异性的单碱基错配核酸检测。

6、在本发明的一些实施方式中，所述t型发夹探针包含地高辛标记的手柄、生物素标记的手柄、目标核苷酸结合部分和帽子结构。

7、在本发明的一些实施方式中，所述探针的目标核苷酸结合部分与所述待测核苷酸部分或完全互补配对；

8、优选地，所述目标核苷酸结合部分与所述无错配核苷酸完全互补配对。所述无错配核苷酸为用于对照的标准品，其与所述t型发夹探针的目标核苷酸结合部分能够完全匹配。

9、在本发明的一些实施方式中，所述t型发夹探针的制备方法包括：

10、步骤s1、将所述地高辛标记的手柄和生物素标记的手柄按1：1摩尔浓度进行连接，得到t型通用手柄；

11、步骤s2、在t4 dna连接酶条件下，将所述t型通用手柄、目标核苷酸结合部分和帽子结构按照摩尔浓度1：5：25的比例连接，即得。

12、在本发明的一些实施方式中，所述待测核苷酸包括单链dna和rna中的至少一种；

13、优选地，所述待测核苷酸的长度大于18nt。

14、在本发明的一些实施方式中，所述恒定力范围为18pn～60pn；

15、优选地，所述恒定力范围为35pn～55pn。

16、在本发明的一些实施方式中所述施加恒定力的工具为单分子力谱工具，其中包括光镊、磁镊、原子力显微镜等。

17、在本发明的一些实施方式中，所述特征结合时间为待测核苷酸与t型发夹探针结合后在结合态驻留的时间。

18、在本发明的一些实施方式中，所述解离速率常数的计算公式为：

19、n＝n0exp[-t/τon]    (7)；

20、

21、其中，n0指时间为0时总的结合态分子数，n指时间为t时剩余的结合态分子数，τon指结合态的衰减寿命，koff指解离速率常数。

22、在本发明的一些实施方式中，计算所述待测核苷酸与所述t型发夹探针结合的碱基数的方法为：

23、①当所述待测核苷酸为单链dna时，计算公式为：

24、

25、②当所述待测核苷酸为rna时，计算公式为：

26、

27、其中，δnnt指所述待测核苷酸与所述t型发夹探针结合的碱基数，δx指所述t型发夹探针的伸长量变化值，xss(f)指恒定力下1nt单链dna的伸长量，xds(f)指恒定力下双链dna一个碱基对的伸长量，xdrh(f)指恒定力下1bp dna/rna杂交链的伸长量；

28、所述xdrh(f)的计算方法为：

29、

30、其中，f为一固定力，lp是驻留长度，dna/rna杂交链取值为52nm，l为1bp dna/rna杂交链的轮廓长度，0.3nm，k是拉伸模量，dna/rna杂交链取值为660pn，kb为玻尔兹曼常数，t为绝对温度，单位为k。

31、在本发明的一些实施方式中，所述xss(f)的计算公式为：

32、

33、其中，f为一固定力，h＝0.34nm，a1＝0.21，a2＝0.34，f1＝0.0037pn，f2＝2.9pn，f3＝8000pn，在150mm nacl下a3＝2；和/或，

34、

35、其中，f为一固定力，lk是ssdna的库恩长度(kuhn length)，lk取值为1.5nm，l为1ntssdna的轮廓长度，为0.57nm，k是拉伸模量，ssdna取值为800pn，kb为玻尔兹曼常数，t为绝对温度，单位为k。

36、在本发明的一些实施方式中，所述xds(f)的计算方法为：

37、

38、其中，f为一固定力，lp是驻留长度，双链dna取值为42nm，l为1bp双链dna的轮廓长度，0.34nm，k是拉伸模量，双链dna取值为1500pn，kb为玻尔兹曼常数，t为绝对温度，单位为k。

39、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。