检测菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的核酸组合物、检测试剂盒和方法与流程

本技术涉及生物，特别涉及一种检测菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的核酸组合物、检测试剂盒和方法。

背景技术：

1、椰毒假单胞酵母菌酵米面亚种是一种存在于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉类发酵产品中的食源性致病菌，由于椰毒假单胞酵母菌酵米面亚种不是国际公开发表和承认的细菌分类科学名称，曾被错误的分类而严重影响了其鉴别方法的开发和应用。目前，在最新修订发布《食品安全国家标准食品微生物学检验》(gb 4789.29—2020)中已将其更名为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种(burkholderia galdioli(pseudomonascocovenenans ssubsp.farinofermentans))。

2、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的外毒素—米酵菌酸是引起食物中毒的主要原因之一。米酵菌酸通过作用于哺乳动物中的线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶，抑制该酶的atp/adp交换过程，抑制有氧呼吸过程，使哺乳动物中毒死亡。米酵菌酸无色无味，在食品中难以被察觉，且具有强热稳定性，经高温烹煮也无法分解失活。目前对米酵菌酸中毒无特效解毒药物，病死率高，为人类健康带来巨大的威胁。如何有效排除米酵菌酸中毒风险是食品检测领域亟待解决的课题。

3、国家标准gb 4789.29-2020中针对该病原菌的检验提供了可供参考的检测方法，但是整体耗时较长(检验周期长达15～20天)，流程繁琐。申请号为2015109092198的中国专利公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的实时荧光pcr检测试剂盒和方法，该方法以实时荧光定量pcr原理对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌进行检测，但该方法无法区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌产米酵菌酸毒株。申请号2020115985247的中国专利公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法、检测用荧光pcr引物和检测检测探针，该方法以荧光定量pcr原理对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞亚种进行检测，整体耗时较长。

4、有鉴于此，有必要开发一种可以快速鉴定食物中是否含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的方法。

技术实现思路

1、本技术的目的之一包括提供一种检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的核酸组合物、检测试剂盒和方法，可以特异性识别唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的目标基因片段，灵敏度高，检测时长短，操作简单。

2、为此，采用了如下技术方案：

3、检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的核酸组合物，其包括：上游外引物对、下游外引物对和环引物对；

4、所述外引物对包括：核苷酸序列包含seq id no:1所示序列的上游外引物和核苷酸序列包含seq id no:2所示序列的下游外引物，

5、所述内引物对包括：核苷酸序列包含seq id no:3所示序列的上游内引物和核苷酸序列包含seq id no:4所示序列的下游内引物，

6、所述环引物对包括：核苷酸序列包含seq id no:5所示序列的上游环引物和核苷酸序列包含seq id no:6所示序列的下游环引物。

7、在一些实施方式中，所述的核酸组合物还包括：

8、核苷酸序列包含seq id no:7所示序列的检测探针；

9、在所述如seq id no:7所示的核苷酸序列中，从5’至3’方向的第13位核苷酸和第14位核苷酸为核糖核苷酸。

10、在一些实施方式中，所述检测探针的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团；

11、可选地，所述检测探针的5’端标记有所述荧光基团，3’端标记有所述淬灭基团。

12、检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的检测试剂盒，其包括所述的核酸组合物。

13、在一些实施方式中，所述的检测试剂盒还包括扩增缓冲液、dntp、核糖核酸酶hii和bst dna聚合酶中的一种或几种。

14、检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的方法，其包括如下步骤：

15、提取待测样品的dna；

16、采用所述的核酸组合物或者所述的检测试剂盒对所述待测样品的dna进行环介导等温扩增，制备扩增产物；以及，

17、对所述扩增产物进行检测。

18、在一些实施方式中，所述扩增的反应体系包括：

19、15mm～25mm的所述上游外引物、15mm～25mm的所述下游外引物、15mm～25mm的所述上游内引物、15mm～25mm的所述下游内引物、15mm～25mm的所述上游环引物、15mm～25mm的所述下游环引物。

20、在一些实施方式中，每25μl扩增的体系包括：

21、0.2μl～0.4μl的所述上游外引物、0.2μl～0.4μl的所述下游外引物、2μl～4μl的所述上游内引物、2μl～4μl的所述下游内引物、0.5μl～0.7μl的所述上游环引物、0.5μl～0.7μl的所述下游环引物。

22、在一些实施方式中，所述环介导等温扩增的程序包括：

23、将扩增的反应体系在60℃～65℃下反应10min～60min。

24、在一些实施方式中，采用所述的核酸组合物或者所述的检测试剂盒对所述待测样品的dna进行扩增的过程中，每隔1min检测所述扩增产物的荧光信号强度；

25、根据所述的荧光信号强度鉴别所述待测样品是否属于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种。

26、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)系统整体上包括根据目的基因的保守序列设计的核酸组合物，该核酸组合物至少包括：上游外引物f3、下游外引物b3、上游内引物fip和下游内引物bip，lamp运行原理是利用dna聚合酶的相关功能对目的基因片段进行特定的指数式体外扩增，以此就可以检测出目的基因，可选地，核酸组合物中还可以包括上游环引物loopf和下游环引物loopb，以便加速核酸扩增反应。

27、本技术基于环介导等温扩增原理设计一种核酸组合物，该核酸组合物可以特异性识别唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的bon基因簇(genbank：jx173632.1)中15792-16010的219bp序列片段，可用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种。

28、本技术的检测方法可以区分唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种和食品中可能存在的其它菌种，包括同源性较低的菌种(如金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌等)和同源性较高的菌种(比如洋葱伯克霍尔德氏菌等)，并且可以将产米酵菌酸毒株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种与不产生米酵菌酸毒的其它唐菖蒲伯克霍尔德氏菌株区分开，为食品安全监测中米酵菌酸项的检测提供重要参考。

29、本技术的检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种的方法灵敏度高，检测时间短，操作简单，适于推广应用。