一种神经坏死病毒CP4蛋白编码基因及制备方法与应用与流程

本发明属于生物工程，涉及一种神经坏死病毒cp4蛋白编码基因及制备方法与应用。

背景技术：

1、石斑鱼是鲈形目（perciformes）、石斑鱼属（epinephelus）鱼类的总称，主要分布于热带、亚热带暖水海域。石斑鱼肉质细嫩鲜美，经济价值高，已成为海水养殖名贵种类之一。石斑鱼易患多种疾病，如烂尾病、溃疡病、虹彩病毒病、病毒性神经坏死病等。其中，由神经坏死病毒（nervous necrosis virus，nnv）引起的石斑鱼病毒性神经坏死病（viralnervous necrosis，vnn）危害最为严重。nnv属诺达病毒科，β-诺达病毒属，结构为直径25~30nm的二十面体，无囊膜，可感染包括石斑鱼在内的多种宿主。vnn一般在4~11月流行，流行时段长，流行高峰集中在夏秋高温季节，主要为5~8月，发病水温多在24~33℃，主要危害稚鱼和幼鱼，感染后病死率可达90%~100%。病鱼表现行为不协调，呈螺旋状游泳有时鳔部肿大，活力下降，漂浮于水面等症状，典型病理变化是中枢神经组织和视网膜组织的坏死和空泡化。

2、神经坏死病毒cp4蛋白用于免疫鱼类，能有效提高鱼体对神经坏死病毒的抵抗力，预防神经坏死病毒病的爆发。浸泡免疫在降低人工成本的同时也保证了鱼类不会产生强烈的应激反应，更适合应用于规模化养殖中。渔用浸泡疫苗的推广过程中遇到的问题之一是疫苗用量大，要保证疫苗效果除了筛选高效抗原表位外，还需要提高用于制备疫苗的蛋白产量。因此在疫苗制备过程中，提高目的蛋白产量降低生产成本就显得十分重要。

技术实现思路

1、本发明的目的：石斑鱼神经坏死病毒cp4蛋白疫苗表现出较好免疫效果，在此基础上，通过开展cp4基因密码子优化、密码子偏好性分析和高效原核表达载体筛选等工作，提高cp4蛋白的原核表达产量，降低实际应用中的疫苗生产成本，为后续石斑鱼神经坏死病毒cp4疫苗生产提供基础。

2、为实现上述技术目的，本发明提供了一种神经坏死病毒cp4蛋白编码基因及制备方法与应用来满足本领域内的这种需要。

3、一方面，本发明涉及一种神经坏死病毒cp4蛋白编码基因，其核苷酸序列如seq idno .1。

4、所述编码基因得到的蛋白的氨基酸序列如seq id no .2所示。

5、另一方面，本发明涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含核苷酸序列如seqid no .1所述的编码基因。

6、进一步地，本发明提供的重组表达载体中，其负载所述编码基因的载体包括：pet-32a或pet28a；优选地，负载所述编码基因的载体为pet-32a。

7、另一方面，本发明涉及一种工程菌，所述工程菌包含上述的重组表达载体。

8、优选地，本发明提供的工程菌为大肠埃希氏菌；更优选地，所述大肠埃希氏菌为 e.  colibl21（de3）。

9、另一方面，本发明涉及一种神经坏死病毒cp4蛋白的制备方法，其包括：将上述的工程菌发酵培养，加入氨苄青霉素或卡那霉素诱导培养至菌液的od600值为1.1~1.3时，再加入iptg继续诱导培养得到所述神经坏死病毒cp4蛋白；所述神经坏死病毒cp4蛋白的氨基酸序列如seq id no .2所示。

10、另一方面，本发明涉及上述的神经坏死病毒cp4蛋白的编码基因或上述的工程菌在制备石斑鱼病毒性神经坏死病疫苗中的应用。

11、与现有技术相比，本发明“一种神经坏死病毒cp4蛋白编码基因及制备方法与应用”具有以下优点：

12、本发明优化后的基因与未优化基因相比，核苷酸序列一致性为81.69%，氨基酸序列一致性为100%。优化后核苷酸序列的cai、cbi和fop均有所升高，enc和gc3s均有所降低，且优化后基因cai数值距离1更近，提示优化后基因在宿主中表达水平更高，表明cp4序列密码子得到较好的优化，cp4-opti序列更适合在大肠杆菌中表达。

13、本发明通过对密码子优化，得到一种神经坏死病毒cp4蛋白编码基因，以pet-32a为基础构建了表达载体，将重组质粒转入大肠埃希氏菌中，筛选制得神经坏死病毒cp4蛋白优势表达菌株，提高了cp4蛋白的产量。

技术特征：

1.一种神经坏死病毒cp4蛋白编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no .1；

2.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的编码基因。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，负载所述编码基因的载体包括：pet-32a或pet28a。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，负载所述编码基因的载体为pet-32a。

5.工程菌，其特征在于，所述工程菌包含权利要求2~4任一项所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠埃希氏菌。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为e. coli bl21。

8.一种神经坏死病毒cp4蛋白的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求5~7中任一项所述的工程菌发酵培养，加入氨苄青霉素或卡那霉诱导培养至菌液的od600值为1.1~1.3时，再加入iptg继续诱导培养得到所述神经坏死病毒cp4蛋白；

9.权利要求1所述的神经坏死病毒cp4蛋白编码基因，或权利要求5~7中任一项所述的工程菌在制备石斑鱼病毒性神经坏死病疫苗中的应用。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种神经坏死病毒CP4蛋白编码基因及制备方法与应用。本发明通过对密码子优化，得到一种神经坏死病毒CP4蛋白编码基因，以pET‑32a为基础构建了表达载体，得到重组质粒转入大肠埃希氏菌中，筛选制得神经坏死病毒CP4蛋白优势表达菌株。本发明通过密码子优化和高效表达载体选择提高了CP4蛋白的表达产量，对石斑鱼病毒性神经坏死病疫苗的规模化生产有积极意义。

技术研发人员：王文博,王二龙,刘高阳,焦铁军,孟强,卢静,马瑞
受保护的技术使用者：深圳万可森生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15