检测结直肠癌的引物探针组合、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及甲基化检测，具体涉及检测结直肠癌的引物探针组合、试剂盒及应用。

背景技术：

1、目前，结直肠癌（colorectal cancer, crc）筛查和早期诊断的方法有肠镜检查、粪便潜血试验（fecal occult blood test, fobt）、粪便免疫化学检测（faecalimmunochemical test, fit）等，其中肠镜是发现肠腺瘤和肠癌的金标准，但由于操作的侵入性，肠道准备繁琐，价格昂贵，存在肠道出血、肠壁穿孔、肠系膜、浆膜撕裂、内脏破裂等风险，部分患者不易接受。fobt是目前唯一得到循证医学证实的crc筛查技术，但检测灵敏度较低。fit相对fobt检测效率略有提升，但是漏诊率和误诊率均较高。粪便dna甲基化基因检测技术侵入性低、灵敏度高、技术简单且方便，是crc早期筛查的有效替代方法。

2、在肠癌粪便基因甲基化检测中，septin9和sdc2通常被用作肠癌的标记物。这种检测可以通过检测粪便中这两种基因的甲基化水平来识别肠癌的存在，具有较高的准确性。通过检测septin9和sdc2的甲基化水平，肠癌的早期筛查可以更加精准，有助于早期发现和治疗。tfpi2在肠癌粪便基因甲基化检测中的应用不如septin9和sdc2广泛，但是有研究表明tfpi2的甲基化水平也可以作为肠癌的标记物和预测肠癌转移的指标。因此，tfpi2在肠癌的诊断和治疗方面也具有一定的潜力。

3、目前结直肠癌甲基化检测多为亚硫酸氢盐转化法。但是，亚硫酸氢盐转化法存在下列缺点：①转化条件较为剧烈，可能会造成dna降解从而影响后续检测的灵敏度；②操作繁琐，转化后还需纯化，可能造成dna损失；③成本较高，为了收集到足够高浓度的dna用于转化，市面上成熟的产品大都在dna提取的过程使用了富集技术；④可能出现转化不完全的情况，从而影响后续检测的准确性；⑤未甲基化的胞嘧啶占人类基因组中总胞嘧啶的95％，未甲基化胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶将严重降低序列复杂性，从而降低了序列特异性并增加后续特异性检测的难度。

4、甲基化敏感型限制性内切酶能够特异性识别酶切靶标并进行酶切，当酶切位点的胞嘧啶呈甲基化时无法被酶切割，将非甲基化的靶标序列进行充分碎片化，而保留完整状态的甲基化序列作为pcr和qpcr的模板。甲基化敏感型限制性内切酶检测方法，避免了使用亚硫酸氢盐转化，不会破坏核酸的完整程度，可以有效提高检测的灵敏度。而将甲基化限制性内切酶技术与荧光pcr技术相结合，在一管内进行酶处理和扩增，可以大幅减少实验的操作难度和时间。

5、但此方法仍的应用仍存在一些难点：①筛选合适的酶以及扩增区域，以保证足够的酶切位点可以切合，从而减少假阳性。②甲基化位点富集的区域，一般cg含量很高(＞65%)，容易形成稳定的二级结构，不利于扩增。③缓冲液体系要兼容酶处理和荧光pcr，要保证甲基化敏感型限制性内切酶在体系中的酶活性，又不能影响荧光pcr扩增，才能保证酶处理和荧光pcr在一管内顺利进行。目前市场上尚无使用甲基化敏感型限制性内切酶技术和荧光pcr同步检测septin9、sdc2和tfpi2基因甲基化的试剂盒。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测结直肠癌的引物探针组合、试剂盒及应用。

2、本发明提供了检测结直肠癌的引物探针组合，其靶向片段包括：

3、如seq id no:49所示核苷酸序列的septin9基因靶向片段；和

4、如seq id no:50所示核苷酸序列的sdc2基因靶向片段；和

5、如seq id no:51所示核苷酸序列的tfpi2基因靶向片段。

6、进一步的，本发明所述的引物探针组合，包括如seq id no:1~seq id no:9所示核苷酸序列中的至少一种。

7、更进一步的，所述的引物探针组合，包括如下所示组合中的至少一种：

8、针对septin9基因靶向片段的如seq id no:1所示核苷酸序列的上游引物，如seqid no:2所示核苷酸序列的下游引物和如seq id no:3所示核苷酸序列的探针；和/或

9、针对sdc2基因靶向片段的如seq id no:4所示核苷酸序列的上游引物，如seq idno:5所示核苷酸序列的下游引物和如seq id no:6所示核苷酸序列的探针；和/或

10、针对tfpi2基因靶向片段的如seq id no:7所示核苷酸序列的上游引物，如seq idno:8所示核苷酸序列的下游引物和如seq id no:9所示核苷酸序列的探针。

11、本发明所述的引物探针组合还包括靶向b2m内参基因的引物组和探针；

12、所述靶向b2m内参基因的引物组的和探针包括：如seq id no:10所示核苷酸序列的上游引物，如seq id no:11所示核苷酸序列的下游引物和如seq id no:12所示核苷酸序列的探针。

13、本发明所述的引物探针组合，

14、每个所述探针的5’偶联一个荧光基团，3’端偶联一个荧光淬灭基团；

15、所述荧光基团选自fam、vic、rox或cy-5中的任意一种；

16、所述荧光淬灭基团选自bhq1、mgb、mgb或bhq2中的任意一种。

17、每个探针5’偶联的荧光基团不同，每个探针3’端偶联的荧光淬灭基团不同。

18、进一步的，在本发明具体实施例中，

19、所述检测septin9基因靶向片段的探针的5’端的荧光基团为fam，3’端的荧光淬灭基团为bhq1；

20、所述检测sdc2基因靶向片段的探针的5’端的荧光基团为vic，3’端的荧光淬灭基团为mgb；

21、所述检测tfpi2基因靶向片段的探针的5’端的荧光基团为rox，3’端的荧光淬灭基团为mgb；

22、在本发明具体实施例中，所述检测b2m内参基因的探针的5’端的荧光基团为cy-5，3’端的荧光淬灭基团为bhq2。

23、本发明中，所述的引物探针组合的靶向片段，是通过深入挖掘公共数据库资源，筛选中国人群结直肠癌早期基因组超甲基化区域，并与正常人群基因组对应区域进行比对，筛选正常人群中低甲基化且含有ccgg和gcgc中至少五个酶切位点可供切割的区域后获得，根据获得的靶标基因片段设计80余对引物及40余条荧光探针（一部分未在本技术体现），筛选出seq id no:1~seq id no:9所示核苷酸序列的扩增效率高，特异性强，稳定性好的引物探针组合，可实现对早期结直肠癌风险的准确判断。

24、进一步的，本发明中的内参基因选择b2m，作为参照，与其他靶向片段成配套体系，其检测区域中未含有上述酶切序列与靶向片段的相组合，不发生酶切。

25、更进一步的，本发明所述的引物探针组合用于结直肠癌检测的覆盖面广，试验结果表明，基于不同靶标基因在不同检测部位的灵敏度和准确度数据的差异，本发明所述的三基因靶向序列联合的引物探针组合可实现癌变位置或癌变严重程度的预测。

26、本发明提供了所述的引物探针组合在制备结直肠癌检测产品中的应用。

27、本发明提供了结直肠癌检测的试剂盒，其包括酶切扩增增强缓冲液、甲基化敏感限制性内切酶、taq dna聚合酶、阳性参考品、阴性参考品或空白对照品中的至少一种和本发明所述的引物探针组合。

28、进一步的，本发明所述的试剂盒中，

29、所述酶切扩增增强缓冲液包括tris-hcl、kc1、mgc12、甘油、bsa、海藻糖、dntp、甜菜碱、dmso和二硫苏糖醇中的至少一种；

30、所述甲基化敏感限制性内切酶包括hpaii和hhai；

31、所述阳性参考品为人结肠癌细胞cw2细胞dna；

32、所述阴性参考品为经测序验证无目标基因甲基化的人基因组dna；

33、所述空白对照品为无核酸酶水。

34、更进一步的，本发明所述的试剂盒中，

35、所述酶切扩增增强缓冲液包括tris-hcl、kc1、mgc12、甘油、bsa、海藻糖、dntp、甜菜碱、dmso和二硫苏糖醇；具体的，所述酶切扩增增强缓冲液包括25~50mmol/l tris-hcl、160~250 mmol/l kc1、20~35mmol/l mgc12、2%~4%(w/v)甘油、6~12 μg/ml bsa、0.3%~0.6%(w/v)海藻糖、0.8~1.2mmol/l dntp、2~4mol/l甜菜碱、2%~6%(w/v)dmso和0.4~0.6mmol/l二硫苏糖醇组成；更具体的，所述酶切扩增增强缓冲液包括45mmol/l tris-hcl、200 mmol/lkc1、30 mmol/l mgc12、3%(w/v)甘油、9 μg/ml bsa、0.5%(w/v)海藻糖、1 mmol/l dntp、2mol/l甜菜碱、2 %(w/v)dmso和0.45 mmol/l二硫苏糖醇。

36、所述甲基化敏感限制性内切酶hpaii和hhai，购自thermo scientific™，使用时按体积比1：1混合制成甲基化敏感限制性内切酶mix，在一次反应体系中（25 μl），通常加入mix的量为1μl，通过针对不同癌症检测的引物探针组合的检测体系优化升级，现用量大大降低，在一次体系中，甲基化敏感限制性内切酶mix加入量为0.1μl。

37、所述taq dna聚合酶的使用浓度为5~10 u/µl，具体的为5 u/µl；

38、所述阳性质控品的使用浓度为2~100ng/μl，具体的为2 ng/μl；

39、所述阴性质控品的使用浓度为2~100ng/μl，具体的为2 ng/μl。

40、所述引物和探针的浓度可以为10～100 μm，具体的为100 μm。

41、本发明甲基化敏感限制性内切酶根据筛选获得的靶标基因片段的筛选要求进行选择，为相适应和配套的体系。本发明中，甲基化敏感限制性内切酶为hpaii和hhai混合而成的酶混合液，分别识别c/cgg，gcg/c序列（其中，斜线表示切割位点）。hpaii和hhai的最佳酶切温度为37℃，同时实现对非甲基化dna模板中含有的ccgg，gcgc序列的酶切。五个以上的酶切位点足以让非甲基化的dna在短时间内被充分碎片化，减少酶切不完全的发生，从而减少假阳性结果的发生，保证检测结果的准确性；试验结果表明，与单独只有hhai切割和未切割的相比较的准确性更高。

42、与基于亚硫酸氢盐转化的甲基化dna检测方法相比，本发明提供的方法极大地缩短了检测时间短，0.1μl甲基化敏感型限制性内切酶mix可以在5min内完成阴性dna模板的切割；且本发明通过体系优化，提供了一种酶切扩增增强缓冲液，可以兼容酶处理和荧光pcr，既能保证甲基化敏感型限制性内切酶在体系中的酶活性，又不能影响荧光pcr扩增，才能保证酶处理和荧光pcr在一管内顺利进行，dna不需要额外提纯，操作步骤进一步简化；dna损失少，检测灵敏度更高。

43、进一步的，甲基化位点聚集的片段往往gc含量较高（＞65%），容易形成稳定的二级结构难以扩增。为了实现拥有5个以上酶切位点的dna片段的扩增，酶切扩增增强缓冲液加入了bsa和甘油等保护剂来保护甲基化敏感型限制性内切酶和taq dna聚合酶活性。除此之外，本发明的酶切扩增增强缓冲液中还加入甜菜碱和dmso作为pcr增强剂，与未添加甜菜碱和dmso的增强缓冲液相比，显著提高了pcr反应体系的荧光强度和扩增效率。

44、本发明提供了非诊断目的的结直肠癌的检测方法，其特征在于，包括利用本发明所述的试剂盒对样本进行检测后，根据检测结果对患结直肠癌的风险进行判定。

45、进一步的，

46、所述判定的标准为：

47、内参b2m的ct值＜35，且septin9、sdc2或tfpi2基因中的任意一个的ct值≤40，判定为阳性；

48、内参b2m的ct值＜35，且septin9、sdc2和tfpi2基因无扩增曲线或ct值＞40，判定为阴性；

49、内参ct值＞35，则核酸浓度低或有抑制物存在，需复检。

50、所述检测的方法为多重荧光定量pcr，所述多重荧光定量pcr的反应程序为：37℃5min；95℃，5min；95℃×15s，60℃×20s，72℃×20s，45个循环。

51、更进一步的，本发明所述样本包括细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、粪便、结肠流出物、血浆、血清、全血或其组合中的至少一种。

52、优选的，所述样本为粪便。

53、本发明所述的非诊断目的的结直肠癌检测方法，其可用于科研目的，用于其他结直肠癌诊断方法、癌变位置预测、癌变严重程度预测等的诊断预测模型的建立和测试，或大数据分析等，具体的可以包括药物治疗模型的建立等。

54、本发明所述的非诊断目的的直肠癌检测方法，其直接样本可为直接可获取或已有的dna。

55、本发明通过比对和筛选获得可用于结直肠癌风险预测的靶标基因片段，根据所述靶标片段设计引物及探针，通过对引物探针组合的筛选获得本发明中扩增效率高，特异性强，稳定性好的引物探针组合，并对检测过程涉及的试剂做了优化，将它们用于早期结直肠癌风险的判别，操作步骤简单、准确性好、灵敏度高，具有广泛的应用前景。