一种检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的引物组合、方法及应用

本发明涉及一种检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的引物组合、方法及应用，属于生物。

背景技术：

1、银耳(tremella fuciform)又名雪耳、白木耳或银耳子等，分类学上隶属担子菌门(basidiomycota)银耳纲(tremellomycetes)银耳目(tremellales)银耳科(tremellaceae)，其外观一般呈菊花状或鸡冠状，半透明，柔软洁白且富有弹性。中医认为银耳性平味甘，具有生津、润肺、止咳的疗效，是典型的药食兼用菌，具有抗肿瘤、抗氧化、辐射防护、抗衰老、改善记忆和保护胃肠等多重益生作用。银耳中富含蛋白质、氨基酸、膳食纤维、多种维生素和矿物质等基本营养成分；此外，银耳中还含有多糖、多酚、黄酮和萜类等生物活性物质，其中银耳多糖具有良好的流变和凝胶特性。

2、我国是银耳人工栽培的发源地，也是世界银耳生产和出口最多的国家，近年来我国银耳生产发展较快，由于银耳良好的食药两用，得到人们的亲睐，人们对银耳的需求量迅速上升。利用自然气候进行银耳的袋料栽培是我国目前银耳生产的主要栽培模式，其具有季节性和地区性的特点，适宜小规模的千家万户栽培，但产品质量难以保证。传统的银耳生产模式制约了当前银耳产业化的发展。随着食用菌工厂化技术的发展，银耳也朝着工厂化的方向发展，目前也有较成熟的技术体系，据报道银耳工厂化栽培的出菇同步率较传统栽培方式提高了16％，栽培周期缩短了5d，周年栽培的批次达到9批次～10批次(蔡丹凤,蔡志欣,郑朋武.银耳工厂化栽培关键技术研究[j].中国食用菌,2017,36(03):37-39.)，效益明显提高。但银耳菌种生产不同于其它食用菌菌种的制作方法，需要有一种叫香灰菌的协同作用下才能完成生活史，因此生产上，银耳菌种主要采取上层银耳菌丝与下层香灰菌菌丝进行混合配比。银耳菌种中银耳菌丝和香灰菌菌丝比例不同，出耳时间以及银耳的耳型长势不同，因此在生产上，建立快速检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的方法对于银耳种植具有重要的指导意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的引物组合、方法及应用。本发明设计银耳与香灰菌基因组中单拷贝基因的特异引物，建立判别银耳菌种中银耳与香灰菌比例的方法，为银耳生产上方便、快速、有效地控制银耳菌种质量提供技术支撑。

2、本发明的目的是通过如下技术方案来实现的：

3、一种用于检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的引物组合，所述引物组合包括银耳基因组中单拷贝基因tub的检测引物和香灰菌基因组中单拷贝基因as-tub的检测引物；

4、所述银耳基因组中单拷贝基因tub的检测引物为：

5、正向引物：5'-cgcaataccaagctccaagc-3'，

6、反向引物：5'-ccaccaagcgagtgggtaat-3'，

7、扩增片段长度为127bp；

8、所述香灰菌基因组中单拷贝基因as-tub的检测引物为：

9、正向引物：5'-aggtctcgtcggagttctca-3'，

10、反向引物：5'-gatggctaccttctccgtcg-3'，

11、扩增片段长度为110bp。

12、上述一种引物组合在检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例中的应用。

13、一种检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的方法，其包括以下步骤：以待测银耳菌种的总dna为模板，利用银耳基因组中单拷贝基因tub的检测引物进行q-pcr扩增，获得待测银耳菌种中银耳单拷贝基因tub的ct值；以待测银耳菌种的总dna为模板，利用香灰菌基因组中单拷贝基因as-tub的检测引物进行q-pcr扩增，获得待测银耳菌种中香灰菌单拷贝基因as-tub的ct值；依据待测银耳菌种中银耳单拷贝基因tub和香灰菌单拷贝基因as-tub的ct值，计算待测银耳菌种中银耳与香灰菌比例；

14、所述银耳基因组中单拷贝基因tub的检测引物为：

15、正向引物：5'-cgcaataccaagctccaagc-3'，

16、反向引物：5'-ccaccaagcgagtgggtaat-3'，

17、扩增片段长度为127bp；

18、所述香灰菌基因组中单拷贝基因as-tub的检测引物为：

19、正向引物：5'-aggtctcgtcggagttctca-3'，

20、反向引物：5'-gatggctaccttctccgtcg-3'，

21、扩增片段长度为110bp；

22、所述q-pcr扩增的体系为：20～50ng/μl的dna模板2μl，2×transscript topgreen qpcr supermix 10μl，10μmol/l的正、反向引物各0.4μl，ddh2o 7.2μl；

23、所述q-pcr扩增的条件为：94℃预变性150s；94℃变性5s，58℃退火30s，40个循环；60℃延伸5s，4℃下保存反应产物。

24、对于特定的银耳菌种样品，银耳与香灰菌的比例是固定的，以同一dna为模板同时用tub检测引物和as-tub检测引物进行q-pcr扩增时，银耳与香灰菌达到相同的荧光阈值，则l1×2ct1×c银耳×2＝l2×2ct2×c香灰，从而可以计算出同一个dna模板中香灰菌与银耳细胞含量的比值c香灰/c银耳＝(2×l1×2ct1)/(l2×2ct2)，即为银耳菌种中香灰菌与银耳的比例；等式中，l1为银耳单拷贝基因tub检测引物的扩增片段长度(127bp)，l2为香灰菌单拷贝基因as-tub检测引物的扩增片段长度(110bp)，ct1为银耳单拷贝基因tub在阈值处的ct值，ct2为香灰菌单拷贝基因as-tub在阈值处的ct值，c银耳为银耳的细胞含量，c香灰为香灰菌的细胞含量，“2×”是因为银耳的1个细胞中含有2个细胞核，即特定基因的拷贝数为2，而香灰菌的1个细胞中只有1个细胞核。

25、上述一种检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的方法方法在评估银耳菌种质量中的应用，当待测银耳菌种中银耳与香灰菌的细胞含量比例小于1：3000时，表明该待测银耳菌种质量低劣、不能正常出耳；当待测银耳菌种中银耳与香灰菌的细胞含量比例为1:20～1:2500时，表明该待测银耳菌种质量较好、能够正常出耳。

26、上述一种检测银耳菌种中银耳与香灰菌比例的方法在指导银耳菌种配制中的应用。

27、一种配制银耳菌种的方法，其是将银耳菌种配制成其中银耳与香灰菌的细胞含量比例为1:2～1:2800。

28、本发明具有检测时间短、操作方便、计算方法简单、结果可靠等优点，具体如下：

29、1)从基因水平上计算银耳菌种中银耳与香灰菌的比例，遗传物质的量更能准确的体现一种生物存在的量，相比传统根据体积经验计算更准确。

30、2)本发明方法的操作技术体系成熟，dna的提取、q-pcr等分子操作技术已被广大分子实验操作者所掌握，同时多数的分子实验室配备了检测所需要的仪器。

31、3)计算公式简单，能快速获得银耳菌种中银耳与香灰菌的比例信息。dna的提取与q-pcr同时可以在当天内完成，并且经q-pcr后即可获得银耳和香灰菌的ct值，便可快速计算出两者的比例。

32、4)与公布的高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法(zl201810310490.3)，至少省弃了建库、高通量测序过程，特别是高通量测序平台涉及特殊的仪器，不是多数的实验室所拥有，此外，高通量测序后，还要经过复杂的数据处理与计算过程才能得出银耳菌种中银耳与香灰菌的比例信息，这里涉及生物信息的知识，不是一般人所能快速掌握的方法。

33、本发明可检测不同银耳菌种中银耳与香灰菌占比情况。银耳菌种是进行银耳种植的基础，由于银耳生活史的特殊性，银耳菌种必须有香灰菌，然而两者的比例关系到银耳种植的成败，本发明提供的银耳与香灰菌比例检测的方法可以评估银耳的菌种质量，以保障银耳种植的安全。