传染性胸膜肺炎APXIV间接ELISA方法建立与流程

本发明涉及生物，特别涉及传染性胸膜肺炎apx iv间接elisa方法建立。

背景技术：

1、猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，pcp)是猪的一种高度传染性呼吸道疾病。病猪和隐性感染的猪都有很强的传染性，猪场一旦感染，净化难度大，经济损失严重，最急性型病例没有任何征兆突然死亡，口鼻流出带血的泡沫样分泌物；急性病例厌食，发烧，呼吸窘迫，用口呼吸，以出血性和坏死性胸膜肺炎为特征，死亡率高；慢性病例表现出较轻的症状，死亡率较低，能克服急性疾病的猪仍会受到慢性感染，虽然没有临床症状，但在鼻腔、扁桃体中带有app，成为病原携带者；胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae，app)是一种革兰阴性短杆状细菌，是pcp的重要致病因子。共有16种血清型(荚膜多糖和脂多糖抗原差异)，17型(8型)和18型(1型)根据生长是否需要nad分为2种生物型：生物ⅰ型和生物ⅱ型；生物ⅰ型：生长依赖nad，如：血清型1-12，血清型15和16型；生物ⅱ型：生长不依赖nad，如：血清型13-14。属于条件致病菌，不同血清型之间的毒力有明显的差异，不同血清型之间不能产生交叉免疫。

2、毒力因子：包括荚膜多糖(cps)、脂多糖(lps)、外膜蛋白(omp)及溶血外毒素(apx)，溶血外毒素(actinobacillus pleuropneumoniae-rtx-toxins，apx)是app重要的毒力因子，其中apxiv最为特殊，其仅在app感染猪时由app所有血清型菌株产生，在体外条件下不产生，并且不会由任何其他细菌产生，自然感染了app的猪体内有针对apxiv的特异性抗体，因此apxiv elisa检测方法被认为是最具特异性的检测方法，apxiv蛋白分子量很大，利用大肠杆菌进行原核表达易形成包涵体，而包涵体的免疫原性较差，因此，对apxiv蛋白进行截短表达，以使其表达在上清，可以有效提高蛋白的免疫原性。

3、防控该病必须采取全面有效的综合防治措施，即从消毒、饲料、饲养管理、引种、免疫接种和药物防治等方面入手。通过控制引种、免疫接种形式是最有效的防控方式，因此，需要一种特异性好、灵敏度高的野毒感染抗体检测试剂盒从源头控制引种app阴性猪，保证后续猪群健康，有利于场区app净化；国内几乎没有可用商品化试剂盒，进口试剂盒因资质及不可抗拒因素，到货困难，且价格昂贵。

4、目前市场上有科前生物、悦洋生物、biostone、idexx、idvet胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒。缺点：

5、1)科前生物胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒敏感性差；

6、2)悦洋生物胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒敏感性差；

7、3)蛮蛮生物胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒敏感性差；

8、4)idexx胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒由于无法清关等不可抗拒因素，国内无法购买；

9、5)idvet胸膜肺炎放线杆菌(包被脂多糖蛋白)间接elisa试剂盒与idexx检测结果不一致，无法得到一致的临床结果。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了传染性胸膜肺炎apx iv间接elisa的方法建立，建立了app apxiv野毒抗体检测试剂盒，支撑猪场app疾病原防控和净化，为行业做出贡献。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了蛋白，具有：

4、(1)、如seq id no:3所示的氨基酸序列；或

5、(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

6、(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；所述多个为2个至30个。

7、本发明还提供了核酸分子，具有编码上述蛋白的核苷酸序列。

8、本发明还提供了表达载体，具有编码上述蛋白的核苷酸序列。

9、本发明还提供了宿主细胞，具有上述蛋白、上述核酸分子或上述表达载体中的一种或两种或多种。

10、本发明还提供了上述蛋白、上述核酸分子或上述表达载体在如下任意项中的应用：

11、(i)、检测猪胸膜肺炎放线杆菌；

12、(ii)、检测猪胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白；

13、(iii)、制备检测猪胸膜肺炎放线杆菌的试剂或试剂盒；

14、(iv)、制备检测检测猪胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白的试剂或试剂盒；

15、所述试剂盒包括检测猪胸膜肺炎放线杆菌apxiv的间接elisa试剂盒。

16、本发明还提供了试剂，包括可接受的辅料或助剂，以及：

17、(a)、上述蛋白；和/或

18、(b)、上述核酸分子；和/或

19、(c)、上述表达载体。

20、本发明还提供了试剂盒，包括上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。

21、本发明还提供了装置，包被上述试剂，还包括可接受的部件。

22、本发明还提供了上述试剂盒或上述装置的制备方法，基于上述蛋白、上述核酸分子或上述表达载体制备。

23、本发明还提供了检测方法，包括取上述试剂盒或上述装置检测待测样品，获得检测结果。

24、本发明的试剂或试剂盒及其应用有如下效果：

25、1)特异验试验结果显示，重组抗原与其它病原(放线杆菌、副猪嗜血杆菌、冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、链球菌、支原体等)阳性血清无交叉反应，表现较高的特异性；

26、2)敏感性试验结果显示，在血清稀释度度为1:800表现阳性，建立的间接elisa方法展现较高的敏感性；

27、3)重复性试验结果显示，建立的间接elisa方法批内变异系数小于5％，批间变异系数小于10％，具有较好的重复性；

28、4)本发明建立的app毒素4间接elisa检测方法与idexx app毒素4间接elisa抗体试剂盒总符合率达90.79％。而科前生物、蛮蛮生物、悦洋生物阳性检出率低于本发明建立的间接elisa检测方法与idexx app毒素4间接elisa抗体试剂盒，idvet app抗体试剂盒与idexx一致性较差。

技术特征：

1.蛋白，其特征在于，具有：

2.核酸分子，其特征在于，具有编码如权利要求1所述的蛋白的核苷酸序列。

3.表达载体，其特征在于，具有编码如权利要求1所述的蛋白的核苷酸序列。

4.宿主细胞，其特征在于，具有如权利要求1所述的蛋白、如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的表达载体中的一种或两种或多种。

5.如权利要求1所述的蛋白、如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的表达载体在如下任意项中的应用：

6.试剂，其特征在于，包括可接受的辅料或助剂，以及：

7.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求6所述的试剂，以及可接受的辅料或助剂。

8.装置，其特征在于，包被有如权利要求6所述的试剂，还包括可接受的部件。

9.如权利要求7所述的试剂盒或如权利要求8所述的装置的制备方法，其特征在于，基于如权利要求1所述的蛋白、如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的表达载体制备。

10.检测方法，其特征在于，包括取如权利要求7所述的试剂盒或如权利要求8所述的装置检测待测样品，获得检测结果。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及传染性胸膜肺炎APX IV间接ELISA方法建立。本发明提供了蛋白及其应用、试剂、试剂盒和检测方法。本发明以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌HBS1株全基因序列设计apxIVA基因片段PCR引物，经全基因合成、扩增产物pET28a‑apxIVA重组质粒构建、大肠杆菌转化、质粒表达、重组蛋白纯化及其反应原性鉴定等试验，并以pET28a‑apxIVA蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法，为猪传染性胸膜肺炎的早期诊断、监测及综合防控提供技术支撑。

技术研发人员：牛旻,郭冠瑛,李亚楠,张娇蕊,李建铭
受保护的技术使用者：牧原食品股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15