一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用与流程

本发明涉及基因工程，特别涉及一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用。

背景技术：

1、弹性蛋白（elastin）属于细胞外基质蛋白(extracellular matrix，ecm)，主要分布于血管、皮肤、韧带和肺等组织器官。弹性蛋白能够提供足够的弹性和恢复力，为组织提供拉伸和恢复其原始形状的能力。弹性蛋白的可溶性前体称为原弹性蛋白（tropoelastin），原弹性蛋白经过自凝聚，交联成不可溶的渔网状结构，称为弹性蛋白。这使得从动物组织中提取弹性蛋白非常困难，这需要分解弹性蛋白分子进行释放，每个原弹性蛋白分子具有36个随机排列的结构域，具有交替的疏水性和亲水性结构域，且异源提取的天然弹性蛋白对人体有一定的排斥反应，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险。而重组弹性蛋白是原弹性蛋白的疏水结构域衍生来的循环重复氨基酸序列，是一种经过人工改造的、具有弹性且随温度变化会发生相变的基因工程多肽，在结构上主要由val-pro-gly-xaa-gly五肽段单元串连重复组成，xaa可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。现有的研究已发现此多肽序列像原弹性蛋白一样具有生物学活性。且不经过任何修饰的类人弹性蛋白可以作为细胞培养表面的修饰物以促进细胞粘附特性和增殖能力，有希望成为新型的生物医学材料。因此，本申请通过获取一种新型重组弹性蛋白，促进其促细胞增殖和促细胞粘附活性，使其能够用于抗衰除皱。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提供一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的重组弹性蛋白促细胞增殖和促细胞粘附活性不足的技术问题。

2、为实现上述目的，本发明提出了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示，编码所述重组弹性蛋白的核苷酸序列如seq idno.6所示。

3、可选地，所述重组弹性蛋白是经毕赤酵母表达的人弹性蛋白与人胶原蛋白的融合蛋白。

4、可选地，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化ⅰ×ⅱ×ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段和类弹性蛋白六肽重复片段所得。

5、可选地， 所述连接肽片段为弹性蛋白亲水区结构域片段。

6、可选地，所述人源化ⅰ×ⅱ×ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段为将如seq id no.1所示的人源ⅰ型胶原蛋白肽片段、如seq id no.2所示的人源ⅱ型胶原蛋白肽片段和如seqid no.3所示的人源ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。

7、可选地，所述类弹性蛋白六肽重复片段为类弹性蛋白六肽氨基酸序列串联重复5次所得。

8、本发明还提出了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：

9、依据如seq id no.6所示的核苷酸序列，构建ppic9k-col-elps重组质粒；

10、制备gs115感受态细胞，并将所述ppic9k-col-elps重组质粒电转化至所述gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；

11、将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清；

12、将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白。

13、可选地，所述依据如seq id no.6所示的核苷酸序列，构建ppic9k-col-elps重组质粒的步骤，包括：

14、依据如seq id no.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入ppic9k质粒上的酶切位点ecor ⅰ和not ⅰ之间，获得ppic9k-col-elps重组质粒。

15、可选地，将所述ppic9k-col-elps重组质粒电转化至所述gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：

16、将所述ppic9k-col-elps重组质粒与所述gs115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌ep管中，经30℃静置孵育1h-2h后，涂布于md固体平板，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；

17、刮下所述md固体平板上的his+转化子并进行稀释后，涂布于含有g418的ypd平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再选取所述ypd平板的单菌落转移至ypd培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌。

18、可选地，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清的步骤，包括：

19、选取所述重组酵母工程菌接种于bmgy诱导培养基中，培养至od600nm吸光值达到2.0-6.0；

20、以3000rpm的转速离心10 min后，收集菌体，重新接种于bmgy诱导培养基中，使od600nm吸光值达到2.0，并在30℃、220 rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清。

21、可选地，将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白的步骤，包括：

22、将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组弹性蛋白。

23、本发明还提出了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有抗衰活性的重组弹性蛋白作为护肤品中的抗衰活性成分。

24、本发明通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构稳定、具有生物学功能的重组人源弹性蛋白，不仅解决了天然蛋白分子量过大，难以从动物组织中提取，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。其中，氨基酸序列如seq id no.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该重组弹性蛋白的核苷酸序列进行优化设计，在c端添加终止子，核苷酸序列如seq id no.6所示。经过体外细胞验证和人体功效验证，该重组弹性蛋白具有比商品化弹性蛋白更明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有明显的抗氧化活性，可应用于生物护肤，并具有明显的抗衰抗皱功效。

技术特征：

1.一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示，编码所述重组弹性蛋白的核苷酸序列如seq id no.6所示。

2.根据权利要求1所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述重组弹性蛋白是经毕赤酵母表达的人弹性蛋白与人胶原蛋白的融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化ⅰ×ⅱ×ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段和类弹性蛋白六肽重复片段所得。

4.根据权利要求3所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述连接肽片段为弹性蛋白亲水区结构域片段。

5.根据权利要求3所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述人源化ⅰ×ⅱ×ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段为将如seq id no.1所示的人源ⅰ型胶原蛋白肽片段、如seq id no.2所示的人源ⅱ型胶原蛋白肽片段和如seq id no.3所示的人源ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。

6.根据权利要求3所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述类弹性蛋白六肽重复片段为类弹性蛋白六肽氨基酸序列串联重复5次所得。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如seq id no.6所示的核苷酸序列，构建ppic9k-col-elps重组质粒的步骤，包括：

9.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，将所述ppic9k-col-elps重组质粒电转化至所述gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：

10.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清的步骤，包括：

11.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白的步骤，包括：

12.一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白在护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1-6任一项所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白作为护肤品中的抗衰活性成分。

技术总结
本发明公开了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组弹性蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。该重组弹性蛋白具有比商品化弹性蛋白更明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有明显的抗氧化活性，可应用于生物护肤，并具有明显的抗衰抗皱功效。

技术研发人员：赵俊,许高涛,李增,赵轩,王蓉,何志远,夏兵兵,许智勇,周炜
受保护的技术使用者：英特菲尔（成都）生物制品有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15