一种chi-miR-335-5p的新用途及其调控靶基因DKK1表达的方法

本发明涉及生物领域，特别是一种chi-mir-335-5p的新用途及其调控靶基因dkk1表达的方法。

背景技术：

1、成熟mirna大小通常为18~25 nt，参与转录后基因调控 (ha and kim, 2014)。mirna的生物发生包括几个步骤，首先是前体rna分子由rna聚合酶ii从基因组转录长度为大约1000 nt左右长的初级mirna（pri-mirna）；然后，含有rnase iii型核酸内切酶drosha将pri-mirna加工成细胞核内的前体mirna（pre-mirna）；pre-mirna通过一个细胞核转运蛋白exportin-5输出到细胞质中，随后细胞质核酸内切酶dicer会对pre-mirna进行下一步切割，形成一个22 nt左右的双链rna。mirna双链中的一条会与rna诱导的沉默复合物结合到其目标基因，另外一条通常会被降解(krol et al., 2010; kim et al., 2016)。

2、mirnas通过其“种子”区（5’端第2~8位核苷酸）与靶基因mrna 3’utr的特定位点（5~8核苷酸）互补能够将argonaute蛋白引导过来，形成risc复合物调节基因表达(treiberet al., 2012)。mirnas主要通过两种方式调控基因表达：翻译抑制和mrna降解。其机制是由mirna与其靶mrna之间的互补程度决定的；高互补性会通过rna介导的干扰途径触发mrna降解；否则，翻译就会受到抑制(yu et al., 2015)。此外，有报道发现mirnas也可以结合到cds区以及5’utr上发挥作用，与cds区结合的mirna同样主要以负调控的方式抑制基因表达，不同的是与5’utr结合的mirna可能主要起转录激活作用(ørom et al., 2008; tay etal., 2008)。

3、在调控毛囊发育发面，许多mirna能够通过靶向一个或多个信号通路调控毛囊的发育。例如，mir-214可以直接降低 β-catenin的表达(ahmed et al., 2014)，也可以靶向 ezh2发挥同样的作用(du et al., 2018)。mir-214的过表达导致异常的毛囊和毛发形成，而这种表型可以被wnt激活剂挽救。mir-214通过直接结合 β-catenin的3’utr调控毛囊发生发育 (ahmed et al., 2014)。与mir-214相似，mir-195-5p通过靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白6（lrp6）抑制wnt/β-catenin激活从而调节毛囊的诱导性(zhu et al., 2018a)。在羊驼模型中，mirna let-7b的表达水平与耳毛和背毛 eda的表达水平呈负相关。let-7b过表达导致 eda mrna和蛋白水平下降，表明let-7b通过靶向 eda基因调控羊驼毛囊的发育，而 eda基因也与少汗性外胚层发育不良相关(liu et al., 2018a)。let-7b也通过转录后的不同机制调控tgf-β受体i来调节 eda的表达 (yan et al., 2016)。其他几个mirna参与毛囊的发育，包括mir-21（靶向 pten,  pdcd4,  timp3,  tpm1和bmp信号通路），mir-24（靶向 tcf-3和wnt/β-catenin通路），mir-218-5p（靶向 sfrp2和wnt/β-catenin通路）和mir-125a（ wnt2和wnt/β-catenin通路） (ahmed et al., 2011; amelio et al., 2013; chen et al.,2018; zhao et al., 2019)。

4、高表达的mirna通常在特定的细胞和组织类型中发挥关键的调控作用(andl andbotchkareva, 2015)。mir-205是一种鳞状上皮mirna，在皮肤祖细胞和干细胞中富集，特别是在bulge的hfscs中。据报道，mir-205敲除小鼠表现出严重的发育缺陷，导致新生儿死亡。mir-205表达的缺失导致毛囊相对较短且角度错位，尽管其对终末分化的影响较弱。mir-205消融也会阻碍hfscs和祖细胞的增殖，提示mir-205对毛囊的形态形成至关重要。此外，mir-205通过直接靶向 pi3k基因调控pi3k通路，表明mir-205对毛囊的影响可能是通过pi3k通路介导的 (wang et al., 2013a)。另一项研究表明，在hf周期中mir-29a/b1的过表达缩短了毛发，并最终通过抑制hfsc和基质细胞分化而导致脱发。wnt和bmp通路与hfsc谱系进展密切相关；mir-29a/b1直接靶向 lrp6、 β-catenin和 bmpr1a，从而抑制wnt和bmp信号通路(ge et al., 2019)。体外过表达mir-214抑制hfsc的增殖和分化，通过直接靶向 ezh2的增强子改变细胞周期，并干扰wnt/β-catenin信号通路；然而，这些发现尚未在体内得到验证(du et al., 2018)。有趣的是，hfscs的一个阳性mirna调控因子也被发现；mir-124被证明可以通过靶向 sox9和 ptbp1促进hfscs的分化 (mokabber et al., 2019)。

5、测序技术的进步促进了几种与色素沉着有关的mirnas的发现。使用illumina测序技术研究白色和棕色羊驼皮肤的mirna表达谱，发现了四种差异表达的mirnas（mir-211、mir-424、mir-202和mir-184）；这些mirnas可能通过靶向与黑色素生成途径相关的基因来调节黑色素生成(tian et al., 2012)。在另一项研究中发现mir-202在c57bl/6黑小鼠皮肤组织中的表达高于balb/c白小鼠皮肤组织，并且 wnt5a、 kit和 tcf7受mir-202的负调控，表明mir-202在黑色素生成中的作用(qu et al., 2017)。此外，mir-10b和mir-211的表达水平在黑色小鼠毛囊中显着高于白色小鼠，有证据表明mir-10b调节mapk和notch信号通路，而mir-211与 mitf相互作用(mazar et al., 2010; mokhtari et al., 2021)。 mitf也是其他几种mirnas靶向的黑色素生成的主要调节因子，包括mir-25、mir-137、mir-148、mir-182、mir-218和mir-340 (bemis et al., 2008; haflidadóttir et al., 2010; zhuet al., 2010; yan et al., 2012; guo et al., 2014; zhao et al., 2017)。此外，mir-137可影响体内色素沉着(bemis et al., 2008)。dong等构建了一个mir-137转基因小鼠模型，其中小鼠毛色根据mir-137的表达水平而变化，从深黑色到浅色不等(dong etal., 2012)。

6、dpcs的外泌体在对hfscs的分化中起关键作用。为了研究在毛囊周期循环中dpcs外泌体调控的作用，yan等共培养dpcs和hfscs，发现在dpcs外泌体中高度富集的mir-22-5p通过直接与 lef1结合，抑制hfsc的增殖 (yan et al., 2019)。mir-140-5p在低传代dpcs外泌体中富集，并靶向 bmp2，促进ors和基质细胞增殖 (chen et al., 2020)。

7、本发明惊喜的发现chi-mir-335-5p能够促进毛囊干细胞(hair follicle stemcells, hfscs)增殖，且lncrna fabp_as能够竞争性结合chi-mir-335-5p调控靶基因dkk1的表达，进而影响wnt/β-catenin信号通路的活性，对与毛囊干细胞有关的药物的制备具有广大的应用前景。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够促进毛囊干细胞增殖的mirna及其调控靶基因dkk1表达的方法， 本发明发现chi-mir-335-5p能够促进毛囊干细胞(hair follicle stem cells, hfscs)增殖，且lncrna fabp_as能够竞争性结合chi-mir-335-5p调控靶基因 dkk1的表达，进而影响wnt/β-catenin信号通路的活性，对与毛囊干细胞有关的药物的制备上有广泛的应用前景。

2、为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

3、一种能够促进毛囊干细胞增殖的mirna，mirna为能够促进毛囊干细胞增殖的chi-mir-335-5p。

4、前述的一种chi-mir-335-5p的新用途 chi-mir-335-5p成熟体（mimic）以及抑制剂序列信息为chi-mir-335-5p mimic/mimic nc/inhibitor/inhibitor nc；序列如下所示：

5、。

6、前述的一种chi-mir-335-5p的新用途 chi-mir-335-5p能够靶向结合 dkk1 3’utr区域。

7、前述的一种chi-mir-335-5p的新用途过表达chi-mir-335-5p能够促进hfscs的增殖，抑制chi-mir-335-5p能够抑制hfscs的增殖。

8、前述的一种chi-mir-335-5p的新用途过表达chi-mir-335-5p能够升高细胞增殖相关基因 mki67和 pcna的表达，抑制chi-mir-335-5p能够降低细胞增殖相关基因 mki67和 pcna的表达。

9、一种调控靶基因dkk1表达的方法,过表达chi-mir-335-5p能够显著降低 dkk1的表达，抑制chi-mir-335-5p能够显著升高 dkk1的表达。

10、前述的一种调控靶基因dkk1表达的方法,过表达lncrna-fabp_as显著抑制hfscs的增殖，而chi-mir-335-5p过表达后能够抵消这一作用，恢复hfscs原有的活力，lncrna-fabp_as竞争性结合chi-mir-335-5p抑制hfscs增殖。

11、一种chi-mir-335-5p在制备治疗与毛囊有关疾病的药物中的应用，前述的chi-mir-335-5p能够促进毛囊干细胞增殖，用于制备治疗与毛囊有关疾病治疗或预防的药物。

12、一种chi-mir-335-5p在制备治疗与毛囊有关疾病的药物中的应用，前述的chi-mir-335-5p能够促进毛囊干细胞增殖，用于制备检测与毛囊有关疾病的试剂盒。

13、专有名词释义：

14、。

15、fabp_as命名原因是：lncrna tcons_00462852在细胞分化期高表达，比对基因组发现其与 a-fabp基因反向互补；fabp_as属于top 15差异表达lncrnas之一，表明其可能参与调控毛囊形态发生过程。

16、本发明的有益之处在于：

17、本发明发现chi-mir-335-5p能够靶向结合 dkk1 3’utr区域，能够促进毛囊干细胞增殖；

18、过表达chi-mir-335-5p能够升高细胞增殖相关基因 mki67和 pcna的表达，抑制chi-mir-335-5p能够降低细胞增殖相关基因 mki67和 pcna的表达；

19、过表达chi-mir-335-5p能够显著降低 dkk1的表达，抑制chi-mir-335-5p能够显著升高 dkk1的表达；

20、过表达lncrna-fabp_as显著抑制hfscs的增殖，而chi-mir-335-5p过表达后能够抵消这一作用，恢复hfscs原有的活力，lncrna-fabp_as竞争性结合chi-mir-335-5p抑制hfscs增殖。

21、本发明提供一种chi-mir-335-5p的新用途，chi-mir-335-5p能够促进毛囊干细胞(hair follicle stem cells, hfscs)增殖，用于制备治疗与毛囊有关疾病的药物。