一株枯草芽孢杆菌及其用途的制作方法

本发明属于微生物，具体涉及一株枯草芽孢杆菌及其用途，特别是其在改善烟叶品质中的应用。

背景技术：

1、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌，广泛分布于土壤等自然环境中，因易在枯草浸出液中繁殖而得名。

2、现有技术已报道枯草芽孢杆菌可以产α-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和果胶酶，并广泛应用于发酵产业。例如，枯草芽孢杆菌通过产淀粉酶和果胶酶，而被用于改善烟叶品质。但现有技术中未有见枯草芽孢杆菌兼产果胶酶和木质素酶(包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶)的报道。

3、微生物常见的发酵方式有固态发酵和液态发酵，固态发酵产物多，但发酵均匀性较差、人力成本高；液态发酵机械化强度高、相对可控，但发酵产物少。固定化发酵方式综合了固态发酵和液态发酵的特点，通过人工构造囊膜，将微生物固定在膜内进行发酵。该方式菌种可回收性强，能多次重复发酵，进而在液态发酵的基础上提高发酵产量。目前，在固定化发酵方式开发中，需对控制底物和菌体代谢产物进出的囊膜的材料、制备工艺进行大量摸索，才能获得满意的效果。

技术实现思路

1、本发明的第一方面提供了一种枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)fm-1，其包含16s rrna核酸，所述16s rrna核酸与seq id no:3所示的核酸具有至少98％的同一性。

2、在某些实施方案中，所述16s rrna核酸与seq id no:3所示的核酸具有至少99％的同一性。

3、在某些实施方案中，所述16s rrna核酸具有如seq id no:3所示的核酸序列。

4、在某些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌fm-1，其保藏号为cgmcc no.24244。

5、本发明的第二方面提供了一种培养物，其包括本发明所述的枯草芽孢杆菌fm-1，以及任选的培养基。

6、在某些实施方案中，所述的培养基包括烟梗。

7、在某些实施方案中，所述烟梗为经过碱处理的烟梗。

8、在某些实施方案中，所述碱处理包括：

9、1)用碱液浸泡烟梗；

10、2)用酸清洗烟梗至中性。

11、在某些实施方案中，所述碱液为氢氧化钠溶液。

12、在某些实施方案中，所述碱液为质量分数0.5-2％的氢氧化钠水溶液。

13、在某些实施方案中，所述酸为盐酸。

14、在某些实施方案中，所述酸为质量分数0.5-2％的盐酸。

15、在某些实施方案中，所述碱处理包括：

16、1)用质量分数0.5-2％的氢氧化钠水溶液浸泡烟梗12-36小时，

17、2)用质量分数0.5-2％的盐酸清洗烟梗1-6小时，

18、3)用水清洗烟梗至中性。

19、在某些实施方案中，所述碱处理还包括对烟梗进行烘干。

20、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为10-40g/l。

21、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为25-35g/l。

22、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为30g/l。

23、在某些实施方案中，所述培养基还包括nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2。

24、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为10-40:1.5-4:0.5-1.5:0.1-0.9:0.1-0.9:0.05-0.15。

25、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为25-35:2-3:0.8-1.2:0.3-0.8:0.3-0.8:0.08-0.12。

26、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为30:2.5:1:0.5:0.5:0.1。

27、在某些实施方案中，所述发酵培养基是液体培养基、固体培养基或半固体培养基。

28、本发明的第三方面提供了一种培养物上清，其为本发明所述的培养物的上清。

29、本发明的第四方面提供了一种组合物，其包括本发明所述的枯草芽孢杆菌fm-1，或本发明所述的培养物，或本发明所述的培养物上清。

30、本发明的第五方面提供了一种组合物，其由本发明所述的培养物上清制备而成。

31、本发明的第六方面提供了一种酶制剂，其中含有果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。

32、在某些实施方案中，所述酶制剂由本发明所述的枯草芽孢杆菌fm-1在培养基中发酵获得，其中，所述培养基包括烟梗。

33、在某些实施方案中，所述烟梗为经过碱处理的烟梗。

34、在某些实施方案中，所述碱处理包括：

35、1)用碱液浸泡烟梗；

36、2)用酸清洗烟梗至中性。

37、在某些实施方案中，所述碱液为氢氧化钠溶液。

38、在某些实施方案中，所述碱液为质量分数0.5-2％的氢氧化钠水溶液。

39、在某些实施方案中，所述酸为盐酸。

40、在某些实施方案中，所述酸为质量分数0.5-2％的盐酸。

41、在某些实施方案中，所述碱处理包括：

42、1)用质量分数0.5-2％的氢氧化钠水溶液浸泡烟梗12-36小时，

43、2)用质量分数0.5-2％的盐酸清洗烟梗1-6小时，

44、3)用水清洗烟梗至中性。

45、在某些实施方案中，所述碱处理还包括对烟梗进行烘干。

46、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为10-40g/l。

47、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为25-35g/l。

48、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为30g/l。

49、在某些实施方案中，所述培养基还包括nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2。

50、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为10-40:1.5-4:0.5-1.5:0.1-0.9:0.1-0.9:0.05-0.15。

51、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为25-35:2-3:0.8-1.2:0.3-0.8:0.3-0.8:0.08-0.12。

52、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为30:2.5:1:0.5:0.5:0.1。

53、在某些实施方案中，所述发酵培养基是液体培养基、固体培养基或半固体培养基。

54、在某些实施方案中，所述酶制剂由包括以下操作的方法制备而成，

55、1)将本发明所述的枯草芽孢杆菌fm-1接种至所述培养基中；

56、2)发酵。

57、在某些实施方案中，步骤2)中所述发酵为在28-32℃、150-250r/min转速下发酵18-30小时。

58、在某些实施方案中，步骤2)中所述发酵在本发明所述的循环发酵装置中进行。

59、在某些实施方案中，步骤2)后还包括以下操作中的至少一项：

60、去除菌体；

61、去除分子量大于150kda的物质；

62、去除分子量小于10kda的物质；

63、干燥发酵液。

64、在某些实施方案中，应用150kda超滤膜去除分子量大于150kda的物质。

65、在某些实施方案中，应用10kda超滤膜去除分子量小于10kda的物质。

66、在某些实施方案中，所述干燥为冷冻干燥。

67、本发明的第七方面提供了本发明所述的枯草芽孢杆菌fm-1或本发明所述的培养物或本发明所述的培养物上清或本发明所述的组合物或本发明所述的酶制剂在烟叶加工中的用途，或在加工烟草原料或制备烟草制品中的用途，或者用于提升烟草制品抽吸感官质量的用途。

68、本发明的第八方面提供了一种处理烟叶的方法，其包括：

69、使本发明所述的组合物或本发明所述的酶制剂接触烟叶表面。

70、在某些实施方案中，所述方法包括以下操作：

71、1)将本发明所述的组合物或本发明所述的酶制剂溶于水，稀释后喷淋于烟叶表面；

72、2)于常温下放置3-5小时后，120-140℃烘烤0.5-2分钟。

73、本发明的第九方面提供了一种烟叶，其由本发明所述的处理烟叶的方法处理获得。

74、本发明的第十方面提供了一种培养基，其包括烟梗。

75、在某些实施方案中，所述烟梗为经过碱处理的烟梗。

76、在某些实施方案中，所述碱处理包括：

77、1)用碱液浸泡烟梗；

78、2)用酸清洗烟梗至中性。

79、在某些实施方案中，所述碱液为氢氧化钠溶液。

80、在某些实施方案中，所述碱液为质量分数0.5-2％的氢氧化钠水溶液。

81、在某些实施方案中，所述酸为盐酸。

82、在某些实施方案中，所述酸为质量分数0.5-2％的盐酸。

83、在某些实施方案中，所述碱处理包括：

84、1)用质量分数0.5-2％的氢氧化钠水溶液浸泡烟梗12-36小时，

85、2)用质量分数0.5-2％的盐酸清洗烟梗1-6小时，

86、3)用水清洗烟梗至中性。

87、在某些实施方案中，所述碱处理还包括对烟梗进行烘干。

88、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为10-40g/l。

89、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为25-35g/l。

90、在某些实施方案中，所述烟梗在培养基中的浓度为30g/l。

91、在某些实施方案中，所述培养基还包括nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2。

92、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为10-40:1.5-4:0.5-1.5:0.1-0.9:0.1-0.9:0.05-0.15。

93、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为25-35:2-3:0.8-1.2:0.3-0.8:0.3-0.8:0.08-0.12。

94、在某些实施方案中，所述烟梗、nano3、kh2po4、mgso4·7h2o、nacl和cacl2的重量比为30:2.5:1:0.5:0.5:0.1。

95、在某些实施方案中，所述发酵培养基是液体培养基、固体培养基或半固体培养基。

96、本发明所述的培养基可用于维持和/或促进枯草芽孢杆菌fm-1生长、繁殖和/或代谢。

97、本发明的第十一方面提供了一种循环发酵富集装置，包括：

98、循环管路，被配置为发酵液可以在其中循环流动；

99、发酵室，安装于所述循环管路内部，被配置为放置菌液和培养基固体成分；

100、富集室，安装于所述循环管路内部，被配置为收集菌株的代谢产物；

101、出液槽，被配置为接收发酵液；

102、进液槽，被配置为储存新鲜的培养基溶液，所述培养基溶液通过泵从进液槽进入循环管路中；

103、泵，被配置为向发酵液提供动力使其在所述循环管路内部循环流动；

104、接种口，其与发酵室连通，被配置为将菌液注入发酵室；

105、其中，

106、所述出液槽通过出液管与循环管路连通；

107、所述进液槽通过进液管与循环管路连通。

108、在某些实施方式中，所述发酵室位于富集室上方。

109、在某些实施方案中，所述的循环发酵富集装置，其中，

110、所述发酵室包括上滤膜盖和下滤膜盖，所述上滤膜盖和下滤膜盖的孔径分别为0.45μm；

111、所述富集室包括上渗透膜盖和下渗透膜盖，所述上渗透膜盖的孔径为100kda-150kda，所述下渗透膜盖的孔径为10kda-30kda。

112、在某些实施方案中，所述的循环发酵富集装置，还包括：

113、温控计，安装于所述循环管路内，以控制循环管路中发酵液的温度；

114、温度计，安装于所述循环管路内，以监测循环管路中发酵液的温度；

115、箱体，所述循环管路、发酵室、富集室、温控计、温度计、出液管、进液管、泵和接种口位于所述箱体中。

116、本发明所述的循环发酵装置可用于枯草芽孢杆菌fm-1发酵。

117、本发明的第十二方面提供了制备酶制剂的方法，其包括以下步骤：

118、1)将本发明所述的枯草芽孢杆菌fm-1接种至本发明所述的培养基中；

119、2)发酵。

120、在某些实施方案中，步骤2)中所述发酵为在28-32℃、150-250r/min转速下发酵18-30小时。

121、在某些实施方案中，步骤2)中所述发酵为在本发明所述的循环发酵装置中进行。

122、在某些实施方案中，所述方法包括以下操作：

123、将所述烟梗放置于发酵室中，所述培养基的其余组分放置于进液槽中；

124、打开泵，使进液槽中的培养基组分通过进液管进入循环管路；

125、关闭泵，使培养基组分静置于循环管路中；

126、通过温控计设定循环管路内温度为28-32℃；

127、从接种口注入本发明所述的枯草芽孢杆菌fm-1；

128、打开泵，使循环管路中的培养基循环并发酵。在某些实施方案中，以4-8次/min的频率进行循环。

129、在某些实施方案中，发酵18-30小时。

130、在某些实施方案中，所述方法还包括以下操作：收集富集室内的产物。

131、在某些实施方案中，所述方法还包括干燥所述产物。在某些实施方案中，所述干燥为冻干。

132、如本文所用，“上方”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本公开和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

133、本发明取得的有益效果：

134、(1)本发明得到了一株新的枯草芽孢杆菌fm-1(cgmccno.24244)，其可以同时产果胶酶、木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶；

135、(2)本发明提供的培养物、培养物上清、组合物、酶制剂能够降解烟叶中的果胶和酸不溶木质素，可以提升烟叶的感官品质，使甜感和浓度增加，香气质和香气量提升，杂气、劲头和刺激性下降；

136、(3)本发明提供的培养基能以烟梗为唯一碳源诱导枯草芽孢杆菌fm-1生产果胶酶、木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶；

137、(4)本发明的循环发酵富集装置可以重复利用培养基组分和菌，能够模拟固定化发酵，用滤膜替代囊膜，省去固定化条件摸索，同时在发酵室的下方设置了富集室，在重力和泵的驱动力下，实现边发酵边对菌体胞外酶进行富集，比常规的固定化发酵省时省力；

138、(5)本发明制备酶制剂的方法操作简便、产酶量高、物料利用率高，发酵结束后只需将富集室取出漂洗、冷冻干燥即得酶粉，无需另外的除菌操作和富集蛋白操作，使用该装置获得酶产量高于常规的摇瓶发酵，且该装置能循环使用烟梗和菌株，在最佳产酶条件下能重复使用3次，提高了物料利用率。

139、关于生物材料保藏的说明

140、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)fm-1已在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiologicalculture collection center,cgmcc)进行保藏，其保藏号为cgmcc no.24244，保藏时间为2022年01月05日。