一种蜈蚣特征肽段及其应用的制作方法

本发明涉及一种蜈蚣药材的鉴别方法，尤其涉及一种蜈蚣特征肽段及应用该特征肽段鉴别检测蜈蚣成分的方法。

背景技术：

1、蜈蚣是蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣(scolopendra subspinipes mutilans l.koch)的干燥体，以全虫入药，是中医传统上一味较为常用的动物药材。

2、中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，相比于传统饮片汤剂具有方便携带，使用简单的特性。蜈蚣配方颗粒是蜈蚣、寻骨风等多种药材经过高温提取、浓缩、干燥、制粒而成，保留了蜈蚣的临床效果，同时兼顾了使用的便携性。

3、蜈蚣药材的鉴别方法已有部分报道。2020版《中国药典》仅收录了蜈蚣药材的性状鉴别，专属性不强，也不适用于蜈蚣成品制剂。也有文献报道(杨成俊,周伟庆.蜈蚣及其混淆品的鉴别研究[j].安徽农业科学,2011,39(25):2.)，利用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蜈蚣药材及其混淆品进行区分鉴别，该方法操作复杂，检测效率较低；除此之外，coi序列的dna条形码技术可用于鉴别蜈蚣药材混伪品(张红印,陈俊,贾静,等.中药材蜈蚣及其混伪品dna条形码鉴别研究[j].中国中药杂志,2014,39(12):4.)，但是中药高温提取过程会影响dna的完整性，进而影响dna条形码鉴定的准确性。

4、相较于dna分子，蛋白质、肽类成分的一级序列信息在高温提取条件下保存较好，可作为蜈蚣药材及其成品制剂的混伪品鉴别，尤其对于蜈蚣配方颗粒这种经过水提取的样品更加具有优势。李彦超等人筛选出三个特征肽用于蜈蚣药材混伪品的区分(李彦超,胡靓君,张琪,等.uflc-ms/ms法分析蜈蚣中3种多肽成分以及在蜈蚣鉴别中的应用[j].南京中医药大学学报,2022,38(10):8.)，但是对于配方颗粒成品制剂并未进行区别研究，申请人采用该文献中的特征肽和方法对蜈蚣配方颗粒进行检测，结果表明3种特征肽在配方颗粒中均未检出，表明该文献中的特征肽和鉴别方法对于缺少外观性状的配方颗粒或成品制剂并不适用(见图1)。这主要是由于配方颗粒成品是由多种药材原料提取浓缩加工制成，因此配方颗粒成品中的多肽或其他组分种类繁多且浓度更高，对于蜈蚣混伪品的鉴别干扰较大，鉴别较为困难。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种蜈蚣特征肽段，解决现有特征肽段无法同时用于单一蜈蚣药材和成品制剂的混伪品鉴别的问题。本发明的另一目的在于提出一种蜈蚣特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，解决现有鉴别方法操作复杂、检测效率较低及准确性低的问题。

2、技术方案：本发明所述的一种蜈蚣特征肽段，其氨基酸序列包括：leu-pro-asp-gly-ala-glu-leu-leu-leu-gly-pro-leu-lys。

3、本发明所述的一种上述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，包括如下步骤：

4、(1)将特征肽配成对照品参照溶液；

5、(2)将蜈蚣酶切后制备对照药材参照溶液；

6、(3)将待检样品酶切后制备待检样品酶解液；

7、(4)采用液相色谱-质谱联用方法分别检测待检样品酶解液、对照药材参照溶液和对照品参照溶液，比较待检样品酶解液、对照药材参照溶液和对照品参照溶液的离子对和离子保留时间，根据比较结果鉴别待检样品中的蜈蚣成分。

8、优选地，所述离子对中母离子为m/z 668.4和m/z 861.7，母离子带双电荷，子离子为m/z611.9和m/z414.4。该特征离子均能在不同批次的蜈蚣质谱图中检测，且响应较高，故选作蜈蚣特征肽的特征离子。

9、优选地，所述步骤(4)中根据比较结果鉴别待检样品中的蜈蚣成分的具体方法为：如果待检样品酶解液中检测出所述离子对，且离子的保留时间与对照药材参照溶液和对照品参照溶液一致，待检样品酶解液的子离子与对照药材参照溶液和对照品参照溶液的子离子一致，则所述待检样品中含有蜈蚣成分。

10、优选地，所述待检样品为蜈蚣干品或制剂成品。本发明中的鉴别方法不仅可以鉴别单一蜈蚣药材的真伪，还可以鉴定蜈蚣制剂成品中是否含有蜈蚣成分。

11、优选地，所述步骤(2)和步骤(3)中酶切的方法为：将蜈蚣或待检样品加入缓冲液中进行提取操作，提取液中加入蛋白酶，恒温酶解即得。本发明中蛋白酶可选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等，通过蛋白酶将蛋白质水解为多肽段，用于后续步骤的检测。

12、优选地，所述缓冲液为tris-hcl缓冲液，按料液比0.2-1g/50ml将蜈蚣或待检样品加入tris-hcl缓冲液；所述提取方法为：将混合有蜈蚣或待检样品的tris-hcl缓冲液超声或回流提取15-60min。

13、优选地，所述蛋白酶恒温酶解的方法为：将所述提取液过滤后加入胰蛋白酶溶液，恒温水浴酶解，加入三氟乙酸终止反应，脱盐，挥干，加水复溶后离心取上清即得。

14、优选地，所述液相色谱-质谱联用方法的液相色谱条件为：以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，采用梯度洗脱：0-2min，10→25％a，2-4min，25→80％a，4-5min，80％a，5-6min，80→10％a。

15、优选地，所述液相色谱-质谱联用方法的质谱参数为：电喷雾离子化为正离子模式，喷雾电压为2.5kv，离子传输毛细管温度为200℃；mrm模式的离子对为：m/z 668.4双电荷→611.9，dp＝94，ce＝35、m/z688.4双电荷→414.4，dp＝96，ce＝44。

16、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明的特征肽专属性强，可同时用于单一蜈蚣药材和成品制剂的混伪品鉴别；本发明应用该特征肽构建的蜈蚣成分鉴别方法操作简单，经过方法学验证，重现性、稳定性、耐用性均较好，检测效率高，有利于蜈蚣药品的质量控制，对保证蜈蚣药品的质量具有重要意义。

技术特征：

1.一种蜈蚣特征肽段，其特征在于，特征肽的氨基酸序列包括：leu-pro-asp-gly-ala-glu-leu-leu-leu-gly-pro-leu-lys。

2.一种如权利要求1所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用。

3.根据权利要求2所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述离子对中母离子为m/z 668.4和m/z 861.7，母离子带双电荷，子离子为m/z611.9和m/z414.4。

5.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述步骤(4)中根据比较结果鉴别待检样品中的蜈蚣成分的具体方法为：如果待检样品酶解液中检测出所述离子对，且离子的保留时间与对照药材参照溶液和对照品参照溶液一致，待检样品酶解液的子离子与对照药材参照溶液和对照品参照溶液的子离子一致，则所述待检样品中含有蜈蚣成分。

6.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述待检样品为蜈蚣干品或制剂成品。

7.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中酶切的方法为：将蜈蚣或待检样品加入缓冲液中进行提取操作，提取液中加入蛋白酶，恒温酶解即得。

8.根据权利要求7所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述缓冲液为tris-hcl缓冲液，按料液比0.2-1g/50ml将蜈蚣或待检样品加入tris-hcl缓冲液；所述提取方法为：将混合有蜈蚣或待检样品的tris-hcl缓冲液超声或回流提取15-60min。

9.根据权利要求7所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述蛋白酶恒温酶解的方法为：将所述提取液过滤后加入胰蛋白酶溶液，恒温水浴酶解，加入三氟乙酸终止反应，脱盐，挥干，加水复溶后离心取上清即得。

10.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，步骤(4)中所述液相色谱-质谱联用方法的液相色谱条件为：以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，采用梯度洗脱：0-2min，10→25％a，2-4min，25→80％a，4-5min，80％a，5-6min，80→10％a；所述液相色谱-质谱联用方法的质谱参数为：电喷雾离子化为正离子模式，喷雾电压为2.5kv，离子传输毛细管温度为200℃；mrm模式的离子对为：m/z 668.4双电荷→611.9，dp＝94，ce＝35、m/z688.4双电荷→414.4，dp＝96，ce＝44。

技术总结
本发明公开了一种蜈蚣特征肽段及其应用，本发明通过大量实验筛选，获得序列为LPDGAELLLGPLK的蜈蚣特征肽，该蜈蚣特征肽具有很高的专属性，可用于鉴别含有蜈蚣药材的样品，特别是失去外观特点的标准汤剂、配方颗粒样品。本发明提供的蜈蚣特征肽的鉴别检测方法，通过对供试品溶液制备方式的考察和色谱条件的优化筛选出最佳检测条件，方法操作简单，对不同种类动物药及非药典基原蜈蚣具有明显区分能力，经过方法学验证，重现性、稳定性、耐用性均较好。应用上述特征肽鉴别蜈蚣，有利于蜈蚣药品的质量控制，对于蜈蚣药材、饮片、制剂成品的真伪鉴别以及质量保证具有重要的意义。

技术研发人员：刘睿,陈盛君,李松,袁健,马丹娜,祝倩倩,翟燕娟,周海琴
受保护的技术使用者：江阴天江药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15