一种类钙调蛋白在调控梨果顶硬化中的应用

本发明属于生物基因工程，具体涉及一种调控梨果顶硬化的类钙调蛋白。

背景技术：

1、梨树是我国重要的落叶果树之一，栽培面积大、产量高，经济效益显著。果顶硬化是一种果实生理病害，其发病部位细胞呈木栓化坏死导致果肉粗糙，引起果实质地及外观品质严重下降。近年来，在‘砀山酥梨’和‘黄金梨’等梨主栽品种上出现该病害，造成价格下跌严重，影响了果实品质和果品市场竞争能力，在一定程度上制约了梨树产业的健康稳定发展。发生果顶硬化症的梨果实萼洼及其周围果皮呈铜绿色，果顶突出，果皮变厚，果肉细胞木质化，口感差，贮藏性和商品性降低，严重影响了果实外观品质和食用品质，大大降低了经济效益，也在一定程度上制约了梨产业的发展。因此，探究其发病机制及有效的防治方法是当前亟待解决的问题。

2、钙素营养被认为是影响果实生理病害的重要因素之一。发明人前期通过分析钙定位及测定钙流速发现，果顶硬化果实中结合态钙和游离态钙均明显少于正常果实，且其果顶端的钙吸收速度也明显低于正常果实，说明钙缺乏是造成果实发生果顶硬化的一个主要原因。发生果顶硬化的病果果顶部位木质素含量明显高于正常果，尤其是在果皮部位，有大量木质素沉积，果顶硬化伴随着木质素的积累。前期已克隆获得了木质素代谢进程中的pal，4cl，cad，pod和ccr等基因，基因表达结果显示，木质素合成途径中ppcad1，ppcad2和ppccr基因在果顶硬化果实中的表达量高于正常果，且采前喷施cacl2处理能够明显抑制果顶硬化症的发生，木质素合成基因的表达也明显降低。因此，梨果顶硬化症的发生表现为木质素逐渐积累，且该过程与钙调控有关。

技术实现思路

1、为了探明梨果顶硬化症的发生机理，本发明提供一种调控果顶硬化的类钙调蛋白。

2、本发明首次发现类钙调蛋白cml38在果顶硬化的梨果实中呈现高表达，且psuper1300-cml38过表达cml38基因后，果顶硬化症状加重，木质素含量升高，木质素合成基因表达增强。ptrv2-cml38沉默cml38表达后，果顶硬化症状减轻，木质素含量降低，木质素合成基因表达减弱。

3、本发明首先以黄金梨正常果实和果顶硬化果实为试材，通过转录组测序分析二者之间的差异基因，鉴定了调控梨果顶硬化的类钙调蛋白cml38，然后设计基因特异性引物，从黄金梨果肉中克隆获得类钙调蛋白cml38全长cdna，通过qpcr验证、亚细胞定位、果实瞬时过表达和瞬时沉默表达发现cml38是调控梨果顶硬化的关键基因。

4、一种序列表seq id no:1所示的核苷酸序列在调控梨果顶硬化中的应用，其特征在于：序列表seq id no:1所示核苷酸序列的类钙调蛋白含423个bp，其中ptrv2为沉默表达载体，实现果顶硬化症状减轻，木质素合成基因表达减弱。

5、进一步限定的技术方案如下：

6、用序列表seq id no:1所示核苷酸序列的类钙调蛋白构建重组载体ptrv2-cml38；

7、采用聚合酶链式反应(pcr)，扩增同时具有ecori酶切位点和bamhi酶切位点的cml38特异性片段，扩增引物为：

8、trv-cml38-f 5’-taaggttaccgaattcaagagcacaaacttccagaaagaaaaacg-3’

9、trv-cml38-r 5’-gctcggtaccggatcccctccctcaagacattaaccttctctt-3’

10、使用clonexpress iione step cloning kit试剂盒，将扩增的cml38特异性片段插入到ptrv2载体中，获得ptrv2-cml38重组质粒；

11、将ptrv2-cml38重组质粒在根癌农杆菌(菌株gv3101，购自上海昂羽生物技术有限公司，上海，中国)中转化，获得trv2-cml38重组载体农杆菌的菌液；用所述菌液配制成抑制梨果实果顶硬化症发生的侵染液；

12、在梨花开花后第100d，在发病果实的萼端果肉上注射1ml侵染液，实现抑制梨果实果顶硬化症的发生。

13、所述ptrv2-cml38重组质粒在根癌农杆菌(菌株gv3101)中的转化操作如下：

14、(1)取5μl ptrv2-cml38重组质粒加到50μl农杆菌感受态(上海昂羽生物技术有限公司，上海，中国)中，冰浴30min，液氮速冻5min，37℃热激5min，再次冰浴5min；

15、(2)在55μl混合物中加入500μl不含抗生素的lb液体培养基，在28℃、转速200r/min的摇床震荡培养3-5h，得到培养后的lb液体培养基；

16、(3)取100μl培养后的lb液体培养基涂布到含有100mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb固体培养基上，28℃恒温培养箱中筛选培养2-3d，得到培养后的lb固体培养基；

17、(4)从培养后的lb固体培养基中挑取单克隆菌落，接种至700μl含有100mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb液体培养基，培养2-3d，菌液由清澈变为浑浊状态即得到trv2-cml38重组载体农杆菌的菌液。

18、所述侵染液的配制操作如下：

19、将所述trv2-cml38重组载体农杆菌的菌液离心，收集菌体；用mma溶液重悬菌体；向重悬后的菌体中加入等体积的辅助载体(trv1)重悬液，暗处静置4-6h，得到trv2-cml38重组载体的侵染液，该侵染液可直接用于瞬时注射。

20、所述离心条件：转速5000rpm、时间10min。

21、本发明的有益技术效果体现在以下方面：

22、1.发明人通过采前喷钙处理，发现钙处理能够减轻果顶硬化症状的发生。ca2+信号转导是需要由ca2+结合蛋白完成的。ca2+与ca2+结合蛋白[钙调蛋白(calmodulin,cam；calmodulin-like,cml)]形成复合体后，直接作用或通过与转录因子互作激活或抑制其转录活性，调控下游基因。作为ca2+信号系统的重要家族成员，类钙调蛋白(cmls)参与植物的各种生理生化过程，包括生长发育、生物胁迫、非生物胁迫和激素作用等。

23、2.目前关于梨果顶硬化的报道较少，本发明通过转录组测序挖掘梨正常果实及果顶硬化症果实间的差异表达基因，进一步通过qpcr验证其表达模式，通过瞬时注射验证其在梨果顶硬化中的功能，筛选出在果顶硬化发生过程中起关键作用的基因cml38基因。沉默cml38基因后，果实果顶硬化症状减轻，相比于对照果实沉默cml38基因的果实钙离子增多，且木质素含量降低了36.7％。通过对ptrv2-cml38沉默的果实萼端进行钙荧光染色观察，发现钙染色强度增加，推测其沉默可能缓解了钙离子的缺乏，从而减轻了果顶硬化症的发生。

技术特征：

1.一种序列表seq id no:1所示的核苷酸序列在调控梨果顶硬化中的应用，其特征在于：序列表seq id no:1所示核苷酸序列的类钙调蛋白含423个bp，其中ptrv2为沉默表达载体，实现果顶硬化症状减轻，木质素合成基因表达减弱。

2.根据权利要求1所述一种序列表seq id no:1所示的核苷酸序列在调控梨果顶硬化中的应用，其特征在于：用序列表seq id no:1所示核苷酸序列的类钙调蛋白构建重组载体ptrv2-cml38；

3.根据权利要求2所述一种序列表seq id no:1所示的核苷酸序列在调控梨果顶硬化中的应用，其特征在于：所述ptrv2-cml38重组质粒在根癌农杆菌中的转化操作如下：

4.根据权利要求2所述一种序列表seq id no:1所示的核苷酸序列在调控梨果顶硬化中的应用，其特征在于：所述侵染液的配制操作如下：

5.根据权利要求4所述一种序列表seq id no:1所示的核苷酸序列在调控梨果顶硬化中的应用，其特征在于：所述离心条件：转速5000rpm、时间10min。

技术总结
本发明公开了一种类钙调蛋白在调控梨果顶硬化中的应用，属于生物基因工程技术领域。序列表SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的类钙调蛋白含423个bp，其中pTRV2为沉默表达载体，实现果顶硬化症状减轻，木质素合成基因表达减弱。用类钙调蛋白构建的重组载体pTRV2‑CML38，在根癌农杆菌中转化，获得菌液，并配制成侵染液；梨花开花后，在发病果实的萼端果肉上注射侵染液，实现抑制梨果实果顶硬化症的发生。本发明以梨正常果实和果顶硬化果实为试材，通过转录组测序筛选出在果顶硬化中高表达的CML38基因，并通过qPCR在2％CaCl<subgt;2</subgt;处理果实中进一步验证CML38的表达模式，进而通过瞬时过表达和瞬时沉默CML38的方法，鉴定CML38在果顶硬化中的关键作用，以期为研究梨果顶硬化症的发生机理提供理论参考。

技术研发人员：杨绍兰,张春建,程晨霞
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15