研究肌醇在花鳗鲡应对高盐度环境的适应性调节的方法

本发明涉及一种鱼类应对高盐度环境的适应性调节的方法，具体涉及一种研究肌醇在花鳗鲡应对高盐度环境的适应性调节的方法。

背景技术：

1、花鳗鲡是典型降河洄游鱼类，在海水中产卵，幼鳗向淡水中迁移，洄游到江河中进行发育。目前，花鳗鲡苗种完全依赖于天然捕捞，由于鳗苗在自然条件下，生存在时常盐度变化的海洋中，在洄游到江河中进行发育时可能会遇到高盐度的挑战，又因为人工驯养难度很大，严重影响了鳗鲡养殖业的健康可持续发展。

2、肌醇(myo-inositol，mi)是一种环状多元醇，在所有原核生物和真核生物域的生物中均有发现，是一种普遍存在的兼容有机渗透物质作为细胞内主要的渗透性物质。肌醇作为多种动物，尤其是水生动物的必需维生素，其缺乏会导致多种疾病，如脂肪蓄积、生长速度减缓以及皮肤病等，还可以通过积累来保护细胞免受环境渗透性的波动。在细胞长时间暴露于高渗状态时，细胞的存活往往取决于相容渗透液的合成或细胞内肌醇的积累。研究表明，肌醇能够缓解这种由盐度胁迫引起的机体损伤。bu等人研究了在长期盐度胁迫下，饲粮中添加400mg/kg肌醇组能够显著提高罗非鱼血清皮质醇、钠离子(na+)和氯离子(cl-)，肝脏转录组结果表明，肌醇可以调节脂质和丙酮酸代谢，提高磷脂相关mrna水平的合成(growth,osmotic response and transcriptome response of the euryhalineteleost,oreochromis mossambicus fed different myo-inositol levels under long-term salinity stress.aquaculture,2021,534:736294)。cu等人研究了大菱鲆在盐度胁迫下，鳃肌醇含量显著增加，又通过肌醇浸泡或投喂肌醇可以显著延长其存活时间，鳃转录组数据表明，肌醇增强了大菱鲆体内与类固醇生物合成、代谢过程，肌醇介导的皮质醇含量与部分离子通道基因表达(aqp1、aqp3)、nka活性和低盐胁迫有明显关系(myo-inositolfacilitates salinity tolerance by modulating multiple physiological functionsin the turbot scophthalmus maximus.aquaculture,2020,527:735451)。

3、在水生动物，尤其是鱼类中，对肌醇的获取主要通过两种途径：通过食物的外源性摄入和内源性肌醇生物合成(myo-inositol biosynthesis，mib)途径。因此，在外源的肌醇摄入受到限制的情况下，内源的mib通路就显得至关重要。mib通路包含两种酶，磷酸-3-肌醇合成酶(mips)和肌醇单磷酸酶(impa1)，二者逐步将葡萄糖-6-磷酸(g6p)转化为游离肌醇。在硬骨鱼中，mib通路在多种器官中都有表达，如：鳃、脑、肝脏、肾脏、心脏等。此外，mib通路是受到盐度胁迫强烈诱导的，在尼罗罗非鱼(oreochromis niloticus)、莫桑比罗非鱼(oreochromis mossambicus)、欧洲鳗鲡(anguilla anguilla)等广盐性鱼类的高渗胁迫研究中均发现不同组织中mib通路的上调现象，以及不同组织中肌醇的显著积累。

4、目前，国内外对肌醇及肌醇合成通路对花鳗鲡高盐胁迫下的调控机制研究并不充分，探究鳗苗应对环境盐度变化的适应性调节机制的相关研究，找到缓解或解决盐度对花鳗鲡的不良影响的方法，有助于提高花鳗鲡天然苗种的成活率，以保护日益稀少的鳗苗资源。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种研究肌醇在花鳗鲡应对高盐度环境的适应性调节的方法，能够促进野生鱼种的人工化养殖以及新品种的选育，还能在人工养殖的条件下，对不断变化的水环境盐度，可以从营养添加肌醇的角度去缓解或解决盐度对鱼类的不良影响。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种研究肌醇在花鳗鲡应对高盐度环境的适应性调节的方法，该方法包含：对采集自不同浓度肌醇和盐度条件饲喂下的花鳗鲡幼鱼的血液样本以及肾脏离体组织进行分析，将肾脏离体组织经液氮处理后匀浆，部分进行转录组测序，部分进行总rna提取，然后采用qpcr方法定量分析和western blot实验，确定不同肌醇浓度水平对花鳗鲡不同盐度胁迫下的nka、aqp1、aqp7、nhe1基因的表达，并对肾切片做免疫组化，进行亚细胞定位，观测nka、aqp1、aqp7、nhe1蛋白在细胞中的定位；对花鳗鲡mib通路中编码核心蛋白的mips和impa1基因进行克隆，然后进行生物信息分析；对所述盐度胁迫后的花鳗鲡幼鱼的脑、鳃、脾、肾、肠、肝离体组织中的mips和impa1基因采用qpcr方法进行表达分析；将采集自注射生理盐水及mips和impa1dsrna的花鳗鲡幼鱼的鳃、肾和肠离体组织，检测肾、鳃和肠离体组织中肌醇的含量，采用qpcr方法检测肾、鳃和肠离体组织中mips和impa1基因表达，检测肾、鳃和肠离体组织中离子转运基因nhe1、aqp1和cftr采用qpcr方法进行表达分析，并测定肾、鳃和肠离体组织中na+-k+-atpase活性；对采集自注射生理盐水及c-myc dsrna的花鳗鲡幼鱼的鳃和肾离体组织，检测鳃和肾离体组织中c-myc、mips和impa1基因采用qpcr方法进行表达分析；对花鳗鲡肾细胞经c-myc抑制剂处理，检测肾细胞中c-myc、mips和impa1的mrna表达。

3、优选地，所述不同浓度肌醇为0、400、800、1200mg/kg；所述盐度为30、55。

4、优选地，不同浓度肌醇和盐度条件饲喂下的花鳗鲡幼鱼的血液样本以及肾脏离体组织，通过以下方法获得：

5、(1)配制不同浓度肌醇的等脂等氮饲粮，将花鳗鲡幼鱼置于盐度为30的水池中，用标准饲粮暂养，以完全适应试验条件；

6、(2)将盐度为30的水池中的花鳗鲡幼鱼随机分组，设定盐度为30的0肌醇添加组、盐度为55的0肌醇添加组，以及盐度为55的不同浓度肌醇添加组；

7、(3)将各组花鳗鲡幼鱼饲养在各组相应条件下的水池中，每天饲喂饲料进行试验，待试验结束后取样，从尾静脉采集血液样本，血液样本离心得到血清；采集肾脏组织，固定在甲醛溶液中，制作石蜡切片。

8、优选地，将各组花鳗鲡幼鱼饲养在各组相应条件下的水池中，饲喂体重3％的饲料，饲喂某一时间后，去除饲料残渣和粪便，水池每日换水量为水池容积的1/3，水温为26～29℃，ph＝6.5～8.5，总氨小于0.05mg/l，溶氧大于5.0mg/l；在最后一次饲喂某一时间后取样。

9、优选地，将所述花鳗鲡肾细胞，在24℃的潮湿环境中，在含有10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100mg·ml-1链霉素的mem培养基中培养肾细胞；将肾细胞接种到培养板中，使其粘附于培养板上，然后用c-myc抑制剂处理，实验结束后从细胞中提取总rna。

10、优选地，所述qpcr方法，针对nka基因的引物序列如seq id no.21和seq id no.22所示；针对aqp1基因的引物序列如seq id no.23和seq id no.24所示；针对aqp7基因的引物序列如seq id no.25和seq id no.26所示；针对nhe1基因的引物序列如seq id no.27和seq id no.28所示。

11、优选地，所述mips和impa1基因进行克隆，针对mips基因采用的引物序列如seq idno.1～2、seq id no.3～4、seq id no.5～6和seq id no.7～8所示；针对impa1基因采用的引物序列如seq id no.9～10和seq id no.11～12所示。

12、优选地，所述qpcr方法，针对mips基因的引物序列如seq id no.13和seq idno.14所示；针对impa1基因的引物序列如seq id no.15和seq id no.16所示。

13、优选地，所述qpcr方法，针对c-myc基因的引物序列如seq id no.31和seq idno.32所示。

14、优选地，参与肌醇在花鳗鲡应对高盐度环境的适应性调节中的mips和impa1蛋白的编码基因的序列分别如seq id no.41和seq id no.42所示。

15、本发明的研究肌醇在花鳗鲡应对高盐度环境的适应性调节的方法，具有以下优点：

16、本发明首次探究了不同浓度肌醇饲粮对花鳗鲡在高盐度下的渗透响应机制，在盐度胁迫下，花鳗鲡自身会产生或积累更多的肌醇以应对渗透胁迫，这与细胞膜上的离子通道蛋白以及水通道蛋白有着极大的关系，通过对花鳗鲡肌醇合成通路(mib)的两个重要基因mips和impa1以及c-myc进行敲降，c-myc抑制剂对mib通路的抑制，全面探究了mib通路对花鳗鲡的渗透调节机制，为肌醇对花鳗鲡在高盐度下的研究提供理论依据。

17、本发明能够对降海洄游性鱼类，在洄游到江河中遇到的高盐度变化，提供理论依据。此外，本发明通过对花鳗鲡渗透压调节机制的研究，可以进行花鳗鲡耐盐选育，甚至培育花鳗鲡以及海洋鱼类的淡水新品种，促进耐盐品种的推广以及提高海洋养殖面积的利用率，突破水资源的限制，促进花鳗鲡产业的可持续发展，实现花鳗鲡养殖模式的转型，从而促进花鳗鲡养殖规模的扩大，从而促进产量和效益的增加，实现花鳗鲡养殖逐渐向低成本地区转移，提高经济效益、社会效益和生态效益。

18、本发明还能在人工养殖的条件下，对不断变化的水环境盐度，可以从营养添加肌醇的角度去缓解或解决盐度对鱼类的不良影响。