家蚕微孢子虫TET基因的应用及家蚕微粒子病检测方法

本发明属于家蚕病原与病害检测。更具体地，涉及家蚕微孢子虫tet基因的应用及家蚕微粒子病检测方法。

背景技术：

1、微孢子虫(microsporidia)是一类专性寄生的单细胞真核生物，属于原生生物门(phylum microsporidia)。微孢子虫广泛存在于自然界中，可以感染各种不同的动物和昆虫。微孢子虫感染可以引起严重的疾病，影响宿主的生长、生殖和免疫功能。

2、家蚕微粒子病是一种由家蚕微孢子虫(nosema bombycis)感染、寄生引起的蚕病，传播方式为食下传染和胚种传染。家蚕微孢子虫一旦感染家蚕，会在家蚕的肠道内形成孢子，这些孢子会传播到其他家蚕身上，导致更广泛的感染，给蚕丝业带来重大威胁。

3、目前家蚕微粒子病的鉴定方法主要包括两种，一是物理鉴定方法，包括外观鉴别和显微镜观察，二是分子鉴定方法，主要是基于ssu-rrna序列和16s-rrna序列设计引物，对家蚕微孢子虫的基因进行pcr检测。相比传统的物理鉴定方法，尽管该分子鉴定法具有准确度和可靠性更高的特点，但其仍然存在特异性不高的问题。目前在对家蚕微粒子病的鉴定上，仍然缺乏特异验证家蚕微孢子虫基因的分子检测手段，发展一种快速检测家蚕微粒子病的分子鉴定方法十分迫切。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供tet基因在检测家蚕微粒子病中的应用。

2、本发明的第一个目的是提供家蚕微粒子病的感染源家蚕微孢子虫的tet基因在检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫中的应用。

3、本发明的第二个目的是提供家蚕微孢子虫的tet基因的检测试剂在检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供家蚕微孢子虫的tet基因在制备家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的检测产品中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供家蚕微孢子虫tet基因的检测试剂在制备家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的检测产品中的应用。

6、本发明的第五个目的是提供一种家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫检测引物组。

7、本发明的第六个目的是提供一种家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫检测试剂盒。

8、本发明的第七个目的是提供一种检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的方法。

9、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

10、本发明针对家蚕微孢子虫四跨膜蛋白tet基因序列(序列号为genbank:dq445481.1)设计了不同的引物，并经过层层筛选，得到一对能特异检测家蚕微孢子虫的引物，所述引物包括上游引物tet15f和下游引物tet15r，上游引物tet15f的核苷酸序列如seqid no.1所示，下游引物tet15r的核苷酸序列如seq id no.2所示。本发明利用该引物对家蚕微粒子病病原家蚕微孢子虫进行检测，结果显示，该引物能够特异性地扩增出430bp大小的目的片段，而对其他病原菌的dna则扩增不出相应的片段。

11、基于该引物良好的特异性和灵敏性，本发明申请保护一种家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫检测引物组，所述引物包括上述的上游引物tet15f和下游引物tet15。

12、此外，本发明还要求保护以下应用：

13、家蚕微孢子虫tet基因或其检测试剂在检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫中的应用。

14、家蚕微孢子虫tet基因或其检测试剂在制备家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的检测产品中的应用。

15、作为一种可实施方案，所述检测试剂为针对家蚕微孢子虫tet基因的特异性引物。

16、优选地，所述特异性引物包括上游引物tet15f和下游引物tet15r；上游引物tet15f的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物tet15r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

17、本发明还申请保护一种家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫检测试剂盒，所述检测试剂盒含有家蚕微孢子虫tet基因的检测试剂。

18、作为一种可实施方案，所述检测试剂为针对家蚕微孢子虫tet基因的特异性引物。优选地，所述特异性引物包括上游引物tet15f和下游引物tet15r；上游引物tet15f的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物tet15r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

19、更优选地，所述试剂盒还包括pcr扩增所需试剂。

20、本发明还申请保护一种检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的方法。具体地，以待测样本的遗传样本为模板，利用上述试剂盒进行检测。具体地，所述遗传样本包括总dna。

21、作为一种可实施的方案，所述检测试剂盒为pcr检测试剂盒时，先对样本进行pcr扩增反应，然后对产物进行凝胶电泳，若出现大小为430bp的扩增条带，则判定待测样本为家蚕微粒子病阳性样本或含有家蚕微孢子虫。

22、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：2×gs taq pcr mix 12.5μl，10pmol/μl的上下游引物各1μl，dna模板2μl，ddh2o 8.5μl。

23、优选地，所述pcr扩增的反应条件为：95℃3min；94℃25s，57℃25s，72℃15s，34个循环；72℃5min。

24、作为一种可实施的方案，所述获取家蚕微孢子虫总dna的方法为：先将家蚕微粒子病病样预处理悬浮液后，进行总dna提取。

25、更具体地，所述预处理是指：将家蚕微粒子病病样放在研钵中研磨，经四层纱布一层脱脂棉过滤，收集滤液，3000r/min离心30～40min，弃上清，用无菌水悬浮沉淀后，再500r/min离心5～8min，去除沉淀杂质后，保留灰白色孢子沉淀，再用无菌水重悬，经多次重复操作直至获得较纯的乳白色孢子为止，将纯化后的孢子液置于4℃冰箱保存备用。

26、优选地，所述家蚕微孢子虫总dna的提取方法为：取纯化后的微孢子虫液，12000r/min离心5～8min，弃上清，保留沉淀，之后使用真菌基因组快速提取试剂盒抽提总dna，置于-20℃保存备用。

27、本发明具有以下有益效果：

28、本发明根据家蚕微孢子虫四跨膜蛋白tet基因序列设计了检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的pcr引物，并最终筛选出了一对能特异性检测家蚕微孢子虫的引物，该引物对家蚕微孢子虫的检测特异性良好，灵敏度高，且检测方法快速高效，适用面广，能够有效运用于家蚕微粒子病的检测，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.家蚕微孢子虫的tet基因在检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫中的应用。

2.家蚕微孢子虫的tet基因的检测试剂在检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫中的应用。

3.家蚕微孢子虫的tet基因在制备家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的检测产品中的应用。

4.家蚕微孢子虫的tet基因的检测试剂在制备家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的检测产品中的应用。

5.根据权利要求2或4所述应用，其特征在于，所述检测试剂包括针对家蚕微孢子虫的tet基因的特异性引物。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述特异性引物包括上游引物tet15f和下游引物tet15r；上游引物tet15f的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物tet15r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

7.一种家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫检测引物组，其特征在于，包括上游引物tet15f和下游引物tet15r；上游引物tet15f的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物tet15r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8.一种家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫检测试剂盒，其特征在于，含有家蚕微孢子虫tet基因的检测试剂。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括权利要求7所述引物组。

10.一种检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，以待测样本的遗传样本为模板，利用权利要求7或8所述试剂盒进行检测。

技术总结
本发明公开了家蚕微孢子虫的四跨膜蛋白TET基因在检测家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫中的应用，以及一种家蚕微粒子病和/或家蚕微孢子虫的检测引物、检测试剂盒及其检测方法。本发明针对家蚕微孢子虫的TET基因，设计并经过多重筛选，最终得到一对能特异检测家蚕微孢子虫的引物，其上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该引物对家蚕微孢子虫的检测特异性良好，灵敏度高，且检测方法快速高效，适用面广，能够有效运用于家蚕微粒子病的检测，具有良好的应用前景。

技术研发人员：刘吉平,张兴楠,李晓东,杨朗
受保护的技术使用者：河池学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25