一种支原体DNA实时荧光PCR检测试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及生物检测，尤其涉及ipc c12q1，更具体地涉及，一种支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒及使用方法。

背景技术：

1、随着现代生物技术的不断发展，生物制剂在临床研究、实验研究方面的应用越来越广，对生物制剂的质量的要求越来越高。

2、在生物制剂生产过程中，容易被实验环境、操作者鼻腔口腔、实验器材等地方的支原体污染，从而影响生物制品的质量，因此支原体dna的检测是生物制品的重要质控标准。

3、现有专利cn201611225518.0公开了一种猪肺炎支原体的实时荧光pcr检测试剂盒及其用途，针对猪肺炎支原体p46基因序列设计的taqman荧光探针及引物，该试剂盒能够特异性地检测猪肺炎支原体，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。但该试剂盒只适用于一种支原体的检测，且适用于特定场所。无法全面检测生物制剂中大部分支原体。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒，包括buffer、引物-探针混合物、内控、阳性模板、无菌水；所述引物-探针混合物包括支原体引物、支原体探针、内控引物和内控探针；所述引物和探针序列包括seq idno.1～6。

2、优选的，所述的buffer包括氯化钾、tris-hcl、氯化镁；进一步优选的，包括400～600mm氯化钾、80～120mm tris-hcl、10～20mm氯化镁。

3、在一种优选的方案中，所述的buffer为500mm氯化钾、100mm tris-hcl(ph8.3)、15mm氯化镁。

4、优选的，所述引物-探针混合物包括8～12μm浓度的支原体引物、8～12μm浓度的支原体探针、8～12μm浓度的内控引物和8～12μm浓度的内控探针；进一步优选的，为10μm浓度的支原体引物、10μm浓度的支原体探针、10μm浓度的内控引物和10μm浓度的内控探针。

5、优选的，所述支原体引物包括支原体上游引物和支原体下游引物；所述内控引物包括内控上游引物和内控下游引物。

6、优选的，所述支原体上游引物为seq id no.1：atgcatcagtacctgag；所述支原体下游引物为seq id no.2：tacgtcgccaacttctgc；所述支原体探针序列为seq id no.3：gtttctcggcaagtgaacgcca；n端与fam基团相连、c端与bhq1基团相连。

7、优选的，所述内控上游引物为seq id no.4：taacatgctcgagggccttac，所述内控下游引物为seq id no.5：tgccttagcagtgccctgtc；所述内控探针序列为seq id no.6：tccacccgtagggagcgtcaac；n端与hex基团相连、c端与bhq1基团相连。

8、优选的，所述支原体包括口腔支原体、关节液支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、发酵支原体、柠檬螺原体、肺炎支原体、唾液支原体。

9、本发明中，通过特定的引物和探针，能特异性扩增ep2.6.7和jp xvii中提到的口腔支原体、关节液支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、发酵支原体、柠檬螺原体、肺炎支原体、唾液支原体10中支原体，而对其它生物制剂中常见的污染细菌和基因组无扩增现象，减少了其它因素对检测结果的影响，提高了检测试剂盒的准确性。本发明人通过对ep2.6.7和jp xvii中10种支原体的研究，创造性地设计了特定的上游引物、下游引物和探针，该特定的上游引物、下游引物和探针与10种支原体匹配性和特异性能好，且具有高度保守的特异荧光探针，引物在进行扩增的过程中，探针发生酶解，能够使荧光积累从而被仪器检测到，并且与其他常见的污染源无交叉。

10、优选的，所述内控的碱基序列为seq id no.7：aacatgctcgagggccttacggcccccgtgggatgctcctacatgtcagga acagttactgacgtaataacgggtgagtccatcataagcgttgacgctccc tacgggtggactgtggagagacagggcactgctaaggc。

11、优选的，所述阳性模板的碱基序列为seq id no.8：gaaaggcgcgcgatacagggtgacagccccgtacacaaaaatgcacatgc tgtgagctcgatgagtagggcgggac。

12、本发明中，通过设置特定的内控和阳性模板，从而提高试剂盒检测的准确度。本发明人发现，当检测特定的10种支原体时，需要有特定的内控和阳性模板作为对照，当内控和阳性模板的碱基序列不恰当，容易导致检测的灵敏度计准确性。本发明人创造性地设计了内控和阳性模板，能相对定量的测出目的支原体的相对表达量。同时，特异性地设计了阳性对照，含有10种支原体共有序列，进而提高了试剂盒检测的准确性。

13、优选的，所述无菌水为纯净水。

14、优选的，所述本发明中的碱基序列由生工、金唯智国内生物合成公司合成。

15、目前，市面上售卖的试剂盒的标准品的扩增效率都较低，且不稳定，且在用于实际操作时，需要操作者在上机检测前进行pcr反应液的配置，该过程繁琐，且操作者很难保证不同批配置的反应液是完全一样的，若是用于比较样品的前后差异，其数据可靠性难以让人信服。本发明中采用的试剂盒简化qpcr反应操作的反应液配置时的操作步骤，试剂盒中有配置好的试剂，可直接用于实验，减少操作者的工作量，节约整个操作时间，且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。

16、本发明第二方面提供了一种支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒的使用方法，包括配制预混液，加入反应孔、设置qpcr程序、结果判定。

17、所述支原体dna实时荧光pcr检测试剂盒的具体使用方法，具体步骤为：

18、s1：配制预混液：将各试剂于冰上融解，buffer试剂上下颠倒轻轻混匀后轻轻离心，其他试剂涡旋混匀后轻微离心；按照表1的组分配制预混液。

19、s2：加入反应孔：按照表2分组，将对应的模板加入到反应孔底部；

20、s3：设置qpcr程序：选择双通道水解探针法程序(fam为支原体检测通道、hex为内控检测通道)设置反应程序，见表3

21、s4：结果判定：阳性：fam通道和hex通道都有扩增曲线，fam通道的ct值小于40；

22、阴性：hex通道都有扩增曲线，fam通道没有扩增曲线，fam通道的ct值大于40；

23、无效结果：hex通道没有扩增曲线，ct值大于40；

24、表1

25、 试剂组分 单孔用量 buffer 15μl 引物-探针混合物 4μl 内控 1μl 总体积 20μl

26、表2

27、 阴性组 10μl无菌水+20μl预混液 阳性组 10μl阳性模板+20μl预混液 实验组 10μl待测样品+20μl预混液

28、表3

29、

30、有益效果

31、1、本发明中，通过特定的引物和探针，能特异性扩增ep2.6.7和jp xvii中提到的口腔支原体、关节液支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、猪鼻支原体、发酵支原体、柠檬螺原体、肺炎支原体、唾液支原体10中支原体，而对其它生物制剂中常见的污染细菌和基因组无扩增现象，减少了其它因素对检测结果的影响，提高了检测试剂盒的准确性。

32、2、本发明中，通过特定的500mm氯化钾、100mm tris-hcl(ph 8.3)、15mm氯化镁，提高了试剂盒的准确度。尤其是mg2+的含量能影响试剂盒的特异性和扩增片段的产率。

33、3、本发明中，通过设置特定的内控和阳性模板，从而提高试剂盒检测的准确度。

34、4、本发明中采用的试剂盒简化qpcr反应操作的反应液配置时的操作步骤，试剂盒中有配置好的试剂，可直接用于实验，减少操作者的工作量，节约整个操作时间，且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。

35、5、试剂盒已完成方法学验证，检测快速，专一性强，性能可靠。