用于鉴定区分两种蝴蝶兰的分子标记及引物

本发明属于生物，具体涉及鉴定华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的分子标记及其应用。

背景技术：

0、背景

1、蝴蝶兰属落叶蝴蝶兰组种类主要有华西蝴蝶兰、尖囊蝴蝶兰、滇西蝴蝶兰、海南蝴蝶兰等。华西蝴蝶兰(phalaenopsis wilsonii)和尖囊蝴蝶兰(phalaenopsis braceana)均属于落叶型蝴蝶兰，附生，其形态特征和生长环境类似，如气生根发达簇生，长而弯曲，表面密生疣状突起；茎短，包被在叶鞘中，长约1厘米，通常具4-5枚叶；叶稍肉质，长圆形或近椭圆形，萼片和花瓣多样，有粉色、绿色、褐色、白色不等，蒴果狭长；花期4-7月，果期8-9月。生于海拔800-2150米的树干上或林下阴湿的岩石上。在自然条件下，花期经常落叶，花时无叶或具1-2枚存留的小叶，在无花时，仅从形态上难以区分不同种类。

2、目前，蝴蝶兰属分类鉴定仍以形态分类和分子生物学方法为主。应用在蝴蝶兰属分类上的dna分子标记有限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism,rflp)标记、随机扩增多态性dna(randomamplified polymorphic dna,rapd)标记、扩增片段长度多态性(amplified fragments length polymorphism,aflp)标记短串联的简单重复序列(simple sequence repeat,ssr，又称为微卫星microsatellite)标记、简单序列重复间区(inter-simple sequence repeat,issr)标记。这些分子标记各有优缺点，rapd标记由于技术难度和成本都较低,使用最多,但易受实验条件影响,稳定性和重复性差,试验结果的可靠性也相对较低。而难度和成本稍高的rflp、issr、ssr应用较少。

3、不同的分子标记在区分种属特别是形态相似的个体间的精确度不一，使得落叶兰组不同亚属、种间分类关系错综复杂。落叶蝴蝶兰种类在落叶后未有花朵时形态特征极为相似，细微差别是唇瓣基部是否有距或爪(金效华，2019，中国野生兰科植物原色图鉴)，而仅凭根系特征难以分辨其种属，纵使专业人士也常有误判。区分不同种属的最显著特征就是花朵特征，但由于即使在花期，由于受气候、地理环境等因素的影响，华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰在花型、花色多样，往往有的个体(变种或变型)间非常接近，特别是在野外采集时无花的情况下，往往很难区分，如图1。因此，非常有必要开发快速、准确区分落叶蝴蝶兰种类，特别是区分华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶的分子标记。

技术实现思路

1、本发明主要针对上述技术问题，提供一种简便的分子标记的方法，实现华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的鉴定区分。具体提供一种鉴定华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的分子标记及其应用。本发明利用高通量测序的方法，从华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰全基因组序列中组装出基因组contigs，并对华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的基因组contigs进行比较。华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰基因组内存在多个长度超过10bp的indel，推测可作为分子标记，通过常规的pcr和琼脂糖凝胶电泳,或通过一代测序对华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰进行鉴定区分。

2、具体地，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种鉴定区分华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的分子标记，所述分子标记包含如下所示任一序列(seq id no:1-seq id no:11)的下划线部分：

4、

5、注：短横线“-”为两个物种的同源序列比对出现的gap位置；jn代表尖囊蝴蝶兰；hx代表华西蝴蝶兰。

6、在一个实施方案中，所述分子标记包含表1中seq id no:1-seq id no:11或其在表1中对应的同源序列。

7、进一步针对上indel序列设计引物，使上indel序列包含在引物扩增产物内部。

8、选择华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰样品，利用设计的引物进行pcr产物片段长度以及两种蝴蝶兰之间差异和预期一致，所述pcr产物均可作为鉴定区分华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的分子标记，所述pcr产物的序列如下：

9、primer1pcr产物

10、hx:

11、acgagaagaataattttcattgccattcctaattattataaattagataagattctaatagatagattatcttatacattattaaattcattattcaattattaaa---------------------aaaaaaattatctattatctatatctaactatatctaaattaagaattaatagaatgaatatattctattttcattttatattatatctatttacttatttactaattgaatttactaattgaatcttagagattctatttctattctcagtatatttagtatattctagtaaattagagtctaaattagaagatttaatctttatagctttatagtaaaaatagtaaaaaagagtaaaagtgttctagtactcttatctagtactcttactagtatatagtatatactaatatagtactaatattgtactaatgtactaaggtttttcgtctttattc-ttttttttttcaagttttcccgcggtggaacaaaata

12、jn:

13、acgagaagaataattttcattgccattcctaattattataaattagataagattctaatagatagattatcttatacattattaaattcattattcaattatttaaaaaaattattcaattatttaaaaaaaaattatctattatctatatctaactatatctaaattaagaattaatagaatgaatatattctattttcattttatattatatctatttacttatttactaattgaatttactaattgaatcttagagattctatttctattctcagtatatttagtatattctagtaaattagagtctaaattagaagatttaatctttatagctttatagtaaaaatagtaaaaaagagtaaaagtgttctagtactcttatctagtactcttactagtatatagtatatactaatatagtactaatattgtactaatgtactaaggtttttcgtctttattctttttttttttcaagttttcccgcggtggaacaaaata

14、primer2pcr产物

15、jn:

16、ggttcaaatcctattggacgcaatttctttctataatttatttctatatatctattctagatagagaatagatatatagaaggaactttattttagaaaggataaaggtccttttttgaatgattcgaatcagaaatatttatgaaatatttattaaggatttctatttattaagatatagaataaaaaaagatatagaataaaaatgatccatttacatttatgtttgttcctgaagtagaaagagttcaatctgttcctgaatagcttctctcaaaagggtttcagcttcttcggt

17、hx:

18、ggttcaaatcctattggacgcaatttctttctataatttatttctatatatctattctagatagagaatagatatatagaaggaactttattttagaaaggataaaggtccttttttgaatgattcgaatcagaaatatttatgaaatatttattaaggatttctatttatt-----------------aagatatagaataaaaatgatccatttacatttatgtttgttcctgaagtagaaagagttcaatctgttcctgaatagcttctctcaaaagggtttcagcttcttcggt

19、primer3pcr产物

20、hx:

21、tgagctatcccatactcccataactatttgatcttagaactatatagaactctatatttagattctatatttatatatagaacataatataagtctatactatatatgtaatgaatatgaattatgaatatgattatgaatatgaaaatctattcaattcaataaaaatagattcaaattcaatatgaatttccattgaatttttcaatgtttcaataatggaaattctattcatattgaagtaatttaaaggaagttcaattaagtcaagttaaaaagaaagaaaaataaagtagtattacttttactactagtaaaagtaaaagtagaaaaagtctagtctataaattctaaatatataaagagtcttaaatagtaagagtatatacttaaatagtaataaatagtaataaatagtaagagtatatcatagtatatatatatatatatatatatactatattactataattactatatactatattactatattatatatactatattactatattaactatattaatagtaactatattaaactatattaaatagagtatatttatataagtcaagtaagtcaagtgaatcttt

22、jn:

23、tgagctatcccatactcccataactatttgatcttagaactatatagaactctatatttagattctatatttatatatagaacataatataagtctatactatatatgtaatgaatatgaattatgaatatgattatgaatatgaaaatctattcaattcaataaaaatagattcaaattcaatatgaatttccattgaatttttcaatgtttcaataatggaaattctattcatattgaagtaatttaaaggaagttcaattaagtcaagttaaaaagaaagaaaaataaagtagtattacttttactactagtaaaagtaaaagtagaaaaagtctagtctataaattagaaatatataaagagtcttaaatattaagagtatatacttaa----------atagtaataaatagtaagagtatatcatag----tatatatatatatatatatactatattactata--ttatatatactatattactatatta-----actatattac--tattaactatattaatagtaactatattaaactatattaaatagagtatatttatataagtcaagtaagtcaagtgaatcttt

24、primer4pcr产物

25、hx:

26、gagagtttgtttgctgtaggacataccttgtttcaaaattcatctaatgtcatcccacttctctttttctttttttttttctcctttcaattctctttctatatgtgatatgtgatgtttaatatagaatgctcttatacttagttctttttcttttctattctacttaattattataacttaattattatacttattatcttaatacttaatatatattttttatatatttttttttttctatttcatattgatcttatatcttagaaatataaagtgaaagtaaagaattccctatcttatactaacttttctattaacttagaataattctagatagtaattctagtactagatagtaattctagtaatatactatagtaataagtaatagtaatatagtaaagaaaaagaagaaattcaattgaaaaagaaaaagaataaaaaaatgataaagaacatatgtaatttcttcatgaaagtggatgaagatagatggg

27、jn:

28、gagagtttgtttgctgtaggacataccttgtttcaaaattcatctaatgtcatcccacttctctttttc-ttttttttttctcctttcaattctctttctatatgtgatatgtgatgtttaatatagaatgctcttatacttagttctttttcttttctattctacttaattattagaacttaattattatacttattatcttaatacttaatatatattttttatata-ttttttttttctatttcatattgatcttatatcttagaaatataaagtgaaagtaaagaattccctatcttatactaacttttctattaacttagaataatt-------------------ctagatagtaattctagtaatatactatagtaataagtaatagtaatatagtaaagaaaaagaagaaattcaattgaaaaagaaaaagaataaaaaaatgataaagaacatatgtaatttcttcatgaaagtggatgaagatagatggg

29、primer5pcr产物

30、hx:

31、ctttcatacggcgggagtcattggttcaaatccaatagtaggtagaacttattagataccggattccatggtatctaataagtttttctactcatcctctttttttcgttctgttctatcatcagattaatcaaattagacttcattgtggtcaatttgtggaatcaagatgtagtgtgtagtatataatatatataataaataaataataaataataataaataaatctttttattttgattgaatgtattgactactaagaggaaattactttgatagcttctactcgtgtcctagc

32、jn:

33、ctttcatacggcgggagtcattggttcaaatccaatagtaggtagaacttattagataccggattccatggtatctaataagtttttctactcatcctctttttttcgttctgttctatcatcagattaatcaaattagacttcattgtggtcaatttgtggaatcaagatgtagtgtgtagtatataatatat-----------ataataaataataataaataaatctttttattttgattgaatgtattgactactaagaggaaattactttgatagcttctactcgtgtcctagc

34、primer6pcr产物

35、hx:

36、aggggcggcaaaattgaatctgatgggtcattgtacatatgcattttagttagtaattcctaattctaatttcatttcaagcaaaaacaaaagatcttgaactaaaattaaaatatcggattatctatgatctatttattagaatagcgaactaggactatatatgtattacaatatacaattcttacaataaatatacaattcttacaatatacaatacaaagaaaataaataagaaaaaaatataaaataaaaaagaaaaaaagaaggaggattttcaatgcaaga

37、jn:

38、aggggcggcaaaattgaatctgatgggtcattgtacatatgcattttagttagtaattcctaattctaatttcatttcaagcaaaaacaaaagatcttgaactaaaattaaaatatcggattatctatgatctatttattagaatagcgaactaggactatatatgtattac--------------------aatatacaattcttacaatatacaatacaaagaaaataaataagaaaaaaatataaaataaaaaagaaaaaaagaaggaggattttcaatgcaaga

39、primer7pcr产物

40、hx:

41、tccaactacaaggagacaggtagtctaatacaaaattcctttaccatcttttgcctcta-tttttttattttat--------------tctagtatttaatagtatttaaagtatagaaattgagatttctattagatttctattttattattttataattttctatattaattcttaatttaatctattatttatttcatattcaatattactatctatataga---------------ctatattaatcgaatagtaaattagtaaatctaaattgataatttctttagtaaatgatccaaaatgaataggtatggaagct

42、jn:

43、tccaactacaaggagacaggtagtctaatacaaaattcctttaccatcttttgcctctattttttttattttattctagtatttaatatctagtatttaatagtatttaaagtatagaaattgagatttctattagatttctattttattattttataattttctatattaattcttaatttaatctattatttatttcatattcaatattactatctatatagactatattaatatagactatattaatcgaatagtaaattagtaaatctaaattgataatttctttagtaaatgatccaaaatgaataggtatggaagct

44、primer8pcr产物

45、hx:

46、cggcaataatgtccctacccatgatgaactatagttattggtgccccctaattttgatatagtcaacatgcttcttttttgttttattttttattgaattc-ttttttttttaattattatagattctcaaaaattattagaaatttcaaatatatatgagacacacacaatctattaatcggatctatttcagatattctaatattctattttcatctataagacttcgggtgctaatgaaatttcatctataagacttcgggtgctaatgaaacg

47、jn:

48、cggcaataatgtccctacccatgatgaactatagttattggtgccccctaattttgatatagtcaacatgcttcttttttgttttattttttattgaattctttttttttttaattattatagattctcaaaaattattagaaatttcaaatatatatgagacacacacaatctattaatcggatctatttcagatattctaatattctat--------------------------------tttcatctataagacttcgggtgctaatgaaacg

49、primer9pcr产物

50、jn:

51、tcctcataagaacgtccacgaatctgatcaattactcttcgtgctttgaaaacagacatacatatatttt---------------gagctaaaacttttgcttctctattttcgttctttatcataaaagttttcccccgccaatgaatga

52、hx:

53、tcctcataagaacgtccacgaatctgatcaattactcttcgtgctttgaaaacagacatacatatattttgagtacatatattttgagctaaaacttttgcttctctattttcgttctttatcataaaagttttcccccgccaatgaatga

54、primer10pcr产物

55、hx:

56、tgagaaaggaccaagatactttgatttccatttcaataacca-----------tgaaatataagtttacgaattcaattcatgttaattttactatatgtatatagatatagaatatctaaagtatagaatatataatctaaagtatagaatatataaagattctagtattctagtatatagaaatctaattatatagttatataggtagaataattatataaattatatagataattatagataatagatagatagaaatagaattaaggatatacaaacaagaagaaccaataccaatgaaaaggcag

57、jn:

58、tgagaaaggaccaagatactttgatttccatttcaataaccatgaaatataagtgaaatataagtttacgaattcaattcatgttaattttactatatgtatatagatatagaat---------------------atctaaagtatagaatatataaagattctagtattctagtatatagaaatctaattatatagttatataggtagaataattatataaattatatagataattatagataatagatagatagaaatagaattaaggatatacaaacaagaagaaccaataccaatgaaaaggcag

59、primer11pcr产物

60、hx:

61、ttttacgtctttgagcgcgcatggatcctttgattagattgcgacgaaaatccgattgttgtgagtaacgtatcaaagctacctcttccgtttgatcatctttttcatcattgttactagtattctgaatac---------------tagaaagagaattggtattctgatcattatcgttataaattatcacacgtttggatcttcttgaatgaatctcataatattcttcctccaaatcttcttcattttcttcttcttctcccaaattctcggt

62、jn:

63、ttttacgtctttgagcgcgcatggatcctttgattagattgcgacgaaaatccgattgttgtgagtaacgtatcaaagctacctcttccgtttgatcatctttttcatcattgttactagtattctgaatactagaaagagaattggtagaaagagaattggtattctgatcattatcgttataaattatcacacgtttggatcttcttgaatgaatctcataatattcttcctccaaatcttcttcattttcttcttcttctcccaaattctcggt

64、在另一个实施方案中，任何包含上述pcr产物序列的dna或rna片段均可作为用于鉴定区分华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的分子标记。

65、第二方面，本发明提供用于扩增上述分子标记的引物，所述引物的扩增产物序列包含有上述分子标记序列。

66、在一个优选实施方案中，本发明的引物包括如primer1-primer11所示的至少一对引物对，优选为包含primer2或primer3或primer4或primer6或primer8或primer9或primer10所示的至少一对引物对序列。

67、

68、注：jn代表尖囊蝴蝶兰，hx代表华西蝴蝶兰。

69、第三方面，本发明提供一种鉴定区分华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的方法，其特征在于包含以下步骤：

70、1)提取待检测样品的总dna；

71、2)对上述总dna进行测序，获得测序序列；

72、3)将上述测序序列比对到dna条形码上，所述dna条形码为seq id no.1至seq idno:11任一条；

73、4)根据测序reads在dna条形码上的覆盖情况判断所述样品的物种。

74、在一个实施方案中，如果测序reads在seq id no.1至seq id no:11任一条序列上能够完全覆盖，则判断待检测样品为测序reads能够完全覆盖的条形码对应的物种。

75、在另一个实施方案中，所述dna条形码为前述任一分子标记。

76、第四方面，本发明提供一种鉴定区分华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的方法，其特征在于包含以下步骤：

77、1)提取待检测样品的总dna；

78、2)利用引物对上述样品的总dna分别pcr，所述引物为包括如primer1-primer11所示的至少一对引物对；

79、3)对pcr产物和标准品进行电泳检测或测序，并根据电泳或测序结果判断待检测样品的物种信息，所述标准品为前述pcr产物。

80、在一个实施方案中，如果pcr产物长度与标准品长度一致，则判断待检测样品为相应标准品对应的物种。

81、在另一个实施方案中，如果pcr产物序列与标准品序列一致，则判断待检测样品为相应标准品对应的物种。

82、第五方面，本发明提供含有上述引物的试剂或试剂盒。

83、第六方面，本发明提供上述分子标记或引物或试剂或试剂盒的以下任一应用：

84、(1)在鉴定鉴定华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰中的应用；

85、(2)在华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

86、(3)在筛选或创制不同华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰品种中的应用；

87、(4)在构建华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的dna指纹数据库中的应用；

88、(5)在华西蝴蝶兰和尖囊蝴蝶兰的种苗质量检测中的应用

89、采用本发明的单一分子标记就能够简单有效区分待测品种是尖囊蝴蝶兰还是华西蝴蝶兰，为尖囊蝴蝶兰还是华西蝴蝶兰的鉴定、种植、资源利用和育种提供保证。也对于兰科植物物种分类、系统发育、系统地理学研究，以及保护和利用兰科资源等方面都具有重要意义。