一种靶向肺部且高表达NKG2D的NK细胞的培养试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于细胞培养，具体涉及一种靶向肺部且高表达nkg2d的nk细胞的培养试剂盒及其应用。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(nature killer cells，nk)是机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，存在于淋巴器官和外周组织中，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等功能，其无须抗原预先致敏就可以直接识别，并且非特异性地杀伤肿瘤细胞，是人体防御体系的第一道屏障。nk细胞具有强大的细胞毒活性，它对刺激因素产生的应答十分迅速，而且免疫应答强度高；同时，nk的杀伤活性无需抗原刺激，也不受mhc分子的限制；此外，nk细胞还具有强大的细胞因子/趋化因子分泌功能，有助于启动和活化其他免疫细胞(如t细胞、b细胞、树突状细胞和内皮细胞等)的应答。

2、表达于nk细胞表面的nkg2d既是激活性受体又是识别性受体，由于肿瘤细胞和一些病原菌感染的细胞均表达nkg2d配体mica、micb和ulbp，因此，高表达nkg2d的nk细胞对上述疾病的治疗至关重要。目前，用市售的nk细胞培养基培养的nk细胞表达nkg2d较低，器官和组织靶向性也较差。因此，目前亟待研究开发一种能够在短周期内大量高效的扩增得到杀伤功能强、靶向性高的nk细胞培养方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种靶向肺部且高表达nkg2d的nk细胞的培养试剂盒，能够高效扩增并活化nk细胞，制备得到一群靶向肺部且高表达nkg2d受体的nk细胞。

2、本发明还提供一种上述试剂盒的应用。

3、本发明还提供一种诱导单个核细胞分化为nk细胞的方法。

4、本发明还提供一种nk细胞。

5、本发明还提供一种药物组合物。

6、本发明还提出上述nk细胞和/或上述药物组合物的应用。

7、根据本发明的第一方面，提出了一种靶向肺部且高表达nkg2d的nk细胞的培养试剂盒，包括活化培养基；所述活化培养基为包含以下中的至少一种的基础培养基：白细胞介素、干细胞因子、干扰素、bmp信号通路激活剂、维生素、糖皮质激素、酪氨酸激酶抑制剂、白细胞介素受体激动剂、tlr激动剂、自体血浆。

8、在本发明的一些实施方式中，所述白细胞介素包括il-2、il-7、il-15、il-18、il-21中的至少一种。

9、在本发明的一些优选的实施方式中，所述白细胞介素在活化培养基中的浓度为：il-25～1200u/ml、il-7 4000～11000u/ml、il-15 1～60ng/ml、il-18 1～60ng/ml、il-211～60ng/ml。

10、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述白细胞介素在活化培养基中的浓度为：il-2 10～1000u/ml、il-7 5000～10000u/ml、il-15 5～50ng/ml、il-18 5～50ng/ml、il-21 5～50ng/ml。

11、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述白细胞介素在活化培养基中的浓度为：il-2 500u/ml、il-7 7000u/ml、il-15 20ng/ml、il-18 20ng/ml、il-21 20ng/ml。

12、在本发明的一些实施方式中，所述干细胞因子在活化培养基中的浓度为1～60u/ml。

13、在本发明的一些优选的实施方式中，所述干细胞因子在活化培养基中的浓度为5～50u/ml。

14、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述干细胞因子在活化培养基中的浓度为20u/ml。

15、在本发明的一些实施方式中，所述干扰素包括干扰素-α。

16、在本发明的一些优选的实施方式中，所述干扰素-α在活化培养基中的浓度为1～120pg/ml。

17、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述干扰素-α在活化培养基中的浓度为1～100pg/ml。

18、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述干扰素-α在活化培养基中的浓度为50pg/ml。

19、在本发明的一些实施方式中，所述bmp信号通路激活剂包括bmp2、bmp4、sb4、sj000291942、sj000063181、sj000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素中的至少一种。

20、在本发明的一些优选的实施方式中，所述bmp信号通路激活剂为芹菜素。

21、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述芹菜素在活化培养基中的浓度为0.05～60μm。

22、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述芹菜素在活化培养基中的浓度为0.1～50μm。

23、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述芹菜素在活化培养基中的浓度为25μm。

24、在本发明的一些实施方式中，所述维生素包括l-抗坏血酸。

25、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述l-抗坏血酸在活化培养基中的浓度为1～60μg/ml。

26、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述l-抗坏血酸在活化培养基中的浓度为5～50μg/ml。

27、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述l-抗坏血酸在活化培养基中的浓度为20μg/ml。

28、在本发明的一些实施方式中，所述糖皮质激素包括地塞米松、氢化可的松中的至少一种。

29、在本发明的一些优选的实施方式中，所述糖皮质激素为氢化可的松。

30、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述氢化可的松在活化培养基中的浓度为0.05～15μm。

31、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述氢化可的松在活化培养基中的浓度为0.1～10μm。

32、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述氢化可的松在活化培养基中的浓度为5μm。

33、在本发明的一些实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼中的至少一种。

34、在本发明的一些优选的实施方式中，所述酪氨酸激酶抑制剂为尼洛替尼。

35、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述尼洛替尼在活化培养基中的浓度为0.01～10nm。

36、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述尼洛替尼在活化培养基中的浓度为0.1nm。

37、在本发明的一些实施方式中，所述白细胞介素受体激动剂包括shr-1501、sot101中的至少一种。

38、在本发明的一些优选的实施方式中，所述白细胞介素受体激动剂为sot101。

39、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述sot101在活化培养基中的浓度为0.001～1.5nm。

40、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述sot101在活化培养基中的浓度为0.001～1nm。

41、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述sot101在活化培养基中的浓度为0.1nm。

42、在本发明的一些实施方式中，所述tlr激动剂包括tlr7激动剂、tlr8激动剂、tlr9激动剂中的至少一种。

43、在本发明的一些优选的实施方式中，所述tlr7激动剂包括tlr7 agonist1、tlr7agonist3、tlr7 agonist9中的至少一种。

44、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述tlr7激动剂为tlr7 agonist3。

45、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述tlr7 agonist3在活化培养基中的浓度为10nm。

46、在本发明的一些优选的实施方式中，所述tlr8激动剂包括tlr8 agonist2、tlr8agonist5、tlr8 agonist6中的至少一种

47、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述tlr8激动剂为tlr8 agonist5。

48、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述tlr8 agonist5在活化培养基中的浓度为10nm。

49、在本发明的一些优选的实施方式中，所述tlr9激动剂包括odn m362、odn m1668、odn m1018中的至少一种

50、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述tlr9激动剂为odn m1018。

51、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述odn m1018在活化培养基中的浓度为10nm。

52、在本发明的一些实施方式中，所述自体血浆在活化培养基中的浓度为4-12v/v％。

53、在本发明的一些优选的实施方式中，所述自体血浆在活化培养基中的浓度为5-10v/v％。

54、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述自体血浆在活化培养基中的浓度为10v/v％。

55、在本发明的一些实施方式中，所述nk细胞的培养试剂盒还包括包被液，所述包被液为包含以下中的至少一种的溶液：tlr激动剂、ncr抗体、cd52抗体、cd137抗体。

56、在本发明的一些优选的实施方式中，所述包被液的溶剂包括磷酸缓冲盐溶液(pbs)、生理盐水。

57、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述包被液的溶剂为生理盐水。

58、本发明的一些优选的实施方式中，所述ncr抗体包括nkp30抗体、nkp44抗体、nkp46抗体中的至少一种。

59、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述ncr抗体在包被液中的浓度为：10μg/ml nkp30抗体、10μg/ml nkp44抗体、10μg/ml nkp46抗体。

60、在本发明的一些优选的实施方式中，所述cd52抗体在包被液中的浓度为：0.1-50μg/ml。

61、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述cd52抗体在包被液中的浓度为：10μg/ml。

62、在本发明的一些优选的实施方式中，所述cd137抗体在包被液中的浓度为：0.1-50μg/ml。

63、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述cd137抗体在包被液中的浓度为：10μg/ml。

64、在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基包括iscove's modifieddulbecco'smedium(imdm)培养基、eagle's basal medium(bme)培养基、mem培养基、dmem培养基，ham's f-12培养基、rpmi1640培养基、fischer's培养基、dmem/f12培养基scgm培养基中的至少一种。

65、在本发明的一些优选的实施方式中，所述基础培养基为scgm培养基。

66、根据本发明的第二方面，提供了一种上述试剂盒在(1)～(2)中任一项中的应用：

67、(1)制备nk细胞；(2)制备诱导单个核细胞分化为nk细胞的产品。

68、在本发明的一些实施方式中，所述单个核细胞来源于人外周血。

69、在本发明的一些实施方式中，所述nk细胞为高表达nkg2d、cxcr3和ccr5的nk细胞。

70、在本发明的一些优选的实施方式中，所述人外周血单个核细胞采用密度梯度离心法分离得到。

71、根据本发明的第三方面，提供了一种诱导单个核细胞分化为nk细胞的方法，包含采用本发明第一个方面的试剂盒的步骤。

72、在本发明的一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：

73、s1：将外周血单个核细胞接种于用包被液包被后的细胞培养容器中，加入活化培养基进行培养至2～4d；

74、s2：将培养2～4d后的细胞转移到新的培养容器中，补充活化培养基并继续培养至6～8d；

75、s3：将培养6～8d后的细胞转移到新的培养容器中，补充活化培养基并继续培养至14～20d，即得nk细胞。

76、在本发明的一些优选的实施方式中，步骤s1中所述包被的条件为：2～6℃下孵育10～14h。

77、在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤s1中所述包被的条件为：4℃下孵育12h。

78、在本发明的一些优选的实施方式中，步骤s1中所述培养的时间为48～96h；进一步为60～84h；更进一步为68～72h。

79、在本发明的一些优选的实施方式中，步骤s2中所述培养的时间为48～144h；进一步为72～120h；更进一步为90～96h。

80、在本发明的一些优选的实施方式中，步骤s3中所述培养的时间为144～288h；进一步为168～264h；更进一步为200～216h。

81、在本发明的一些优选的实施方式中，上述步骤中培养的条件为35～38℃、4～6％co2。

82、在本发明的一些更优选的实施方式中，上述步骤中培养的条件为37℃、5％ co2。

83、在本发明的一些优选的实施方式中，步骤s1所述细胞培养容器包括t75培养瓶，步骤s2所述细胞培养容器包括t175培养瓶，步骤s3所述细胞培养容器包括1l培养袋。

84、在本发明的一些优选的实施方式中，所述接种的步骤中，单个核细胞接种浓度为2.5～6×106个/ml。

85、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述接种的步骤中，单个核细胞接种浓度为3～5×106个/ml。

86、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述接种的步骤中，单个核细胞接种浓度为3×106个/ml。

87、在本发明的一些实施方式中，所述补充活化培养基的步骤后，单个核细胞的浓度为1.5～5×106个/ml。

88、在本发明的一些优选的实施方式中，所述补充活化培养基的步骤后，单个核细胞的浓度为2～4×106个/ml。

89、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述补充活化培养基的步骤后，单个核细胞的浓度为3×106个/ml。

90、在本发明的一些优选的实施方式中，步骤s1-s3中所述的培养为悬浮培养。

91、根据本发明的第四方面，提供了一种nk细胞，通过本发明第一方面的试剂盒和/或本发明第三方面的方法制备得到。

92、在本发明的一些实施方式中，所述nk细胞中cd3-cd56+细胞的含量为80％以上、82％以上、84％以上或86％以上。

93、在本发明的一些优选的实施方式中，所述nk细胞中cd3-cd56+细胞的含量为86％以上。

94、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述nk细胞中cd3-cd56+细胞的含量为86.2％。

95、在本发明的一些实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中nkg2d+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上或98％以上。

96、在本发明的一些优选的实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中nkg2d+细胞的含量为98％以上。

97、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中nkg2d+细胞的含量为98.5％。

98、在本发明的一些实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中cxcr3+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上或98％以上。

99、在本发明的一些优选的实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中cxcr3+细胞的含量为98％以上。

100、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中cxcr3+细胞的含量为99.0％。

101、在本发明的一些实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中ccr5+细胞的含量为80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、94％以上、96％以上、98％以上或99％以上。

102、在本发明的一些优选的实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中ccr5+细胞的含量为99％以上。

103、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述cd3-cd56+的nk细胞中ccr5+细胞的含量为99.7％。

104、根据本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，包含本发明第四方面的nk细胞。

105、在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

106、在本发明的一些优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、dmso、及其组合。

107、在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物为液体制剂。

108、在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物组合物为静脉注射试剂。

109、在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包含抗肿瘤药物和/或抗病毒药物。

110、在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗肿瘤药物为治疗肺癌的药物。

111、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、吉西他滨、培美曲赛、依托泊苷、卡铂、顺铂、洛铂、吉非替尼中的至少一种。

112、在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗病毒药物包括阿昔洛韦、奥司他韦、利巴韦林、更普洛韦中的至少一种。

113、在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物中nk细胞和所述抗肿瘤药物和/或抗病毒药物混合或独立存在。

114、根据本发明的第六方面，提供了本发明第四方面的nk细胞和/或本发明第五方面的药物组合物在(1)～(2)中任一项中的应用：

115、(1)制备预防和/或治疗肿瘤的药物；

116、(2)制备预防和/或治疗病毒感染的药物。

117、在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胶质瘤中的至少一种。

118、在本发明的一些优选的实施方式中，所述肿瘤为肺癌。

119、在本发明的一些更优选的实施方式中，所述肺癌包括小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、大细胞肺癌中的至少一种。

120、在本发明的一些实施方式中，所述病毒感染包括肺部病毒感染。

121、本发明至少具有以下有益效果：

122、本发明提供了一种诱导单个核细胞分化为nk细胞的试剂盒，还基于上述试剂盒提出了一种高效且明确的、用于诱导nk细胞的培养方法，该方法在体外培养外周血单个核细胞16～20天后，能使nk细胞扩增500～800倍，nk细胞比例＞85％，表达靶向肺部的标志性趋化因子受体ccr5和cxcr3的阳性细胞比例均超过95％，同时nkg2d阳性率＞98％。此外，本方案制备得到的nk细胞，在体外对a549肺癌细胞的杀伤率＞90％。本发明提供的培养方法使用了上述试剂盒中包含多种活性组分的活化培养基和培养瓶包被液，这些活性组分复配使用后能够发挥协同增效作用，培养得到一群高纯度的靶向肺部且高表达nkg2d受体的nk细胞，可以用于解决现有技术中nk细胞体外扩增中存在的nk细胞组织靶向性弱、杀伤活性较差的问题，进一步为肺癌和肺部病毒感染提供一种新的治疗思路和技术支持。