一种人脐血长期造血干细胞体外扩增培养方法和体系

本发明属于细胞培养，具体涉及一种人脐血长期造血干细胞体外扩增培养方法和体系。

背景技术：

1、造血干细胞(hematopoietic stem cells，hscs)是在胚胎发育过程中产生主要用于血液系统再生维持的细胞，在人类疾病治疗方面有着广泛的应用。造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，hsct)是免疫缺陷和白血病等疾病的有效治疗手段，与骨髓和外周血相比，脐带血来源的hscs具有更高的增殖潜能，能表现出更强的自我更新能力。由于胎儿免疫系统尚未成熟，脐血移植(umbilical cord bloodtransplantation，ucbt)具有许多优点，如对移植物抗宿主病(graft versus hostdisease，gvhd)等不良反应发生率低且程度轻、供受体间的免疫相容性要求较低等。

2、然而，自1988年gluckman等报道首例ucbt至今的30多年时间里，ucbt虽然得到了迅猛的发展，但只有约7％需接受hsct的患者选择了ucbt，究其原因，主要是由于脐带血中的hscs绝对数量较少而不足以生成一个成年人的造血系统，导致中性粒细胞植入延迟，从而易产生较高频率的感染、出血和严重的急性移植物抗宿主病(acute graft versus hostdisease，a-gvhd)，甚至导致移植相关死亡。

3、脐血源hscs的体外扩增是现阶段诸多研究人员关注的热点，其目的是在维护hscs干性的基础上实现数量的大幅扩增。大量实验数据表明，扩增后细胞群中长期造血干细胞(long term hematopoietic stem cells，lt-hscs)的比例和绝对数量对受体能否长期稳定地重建多系造血至关重要。现应用的多种扩增方法对lt-hscs的扩增效果不佳，例如补充细胞因子、铜螯合剂四乙基五胺(tetraethylenepentamine，tepa)、芳香族受体拮抗剂stemregenin-1(sr1)等，故hscs最佳的体外扩增条件至今尚没有明确的共识。

技术实现思路

1、为突破大量扩增脐血源性lt-hscs的技术难点，本发明提供了一种以低氧共培养模式为基础的，辅助添加聚乙烯醇及烟酰胺的高效扩增造血干细胞的体外扩增体系。

2、为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

3、一种人脐血长期造血干细胞体外扩增培养体系，所述体系包括以人脐带mscs与人脐血hscs利用添加聚乙烯醇及烟酰胺的共培养细胞培养液，在低氧环境下进行共同培养；

4、所述共培养细胞培养液主要成分为：基础无血清培养基imdm；其余添加组分及浓度：重组人干细胞因子50-150ng/ml、重组人血小板生成素100-300ng/ml、重组人fms样酪氨酸激酶3配体100-200ng/ml、聚乙烯醇4-8mg/ml；烟酰胺5-10mm。

5、进一步地，所述低氧环境的建立方法为：将氮气与二氧化碳两种气体同时通入培养箱中，用测氧仪测定培养箱内氧气的浓度保持在1-5％，同时维持二氧化碳5％浓度。

6、一种如上所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养体系的培养方法，步骤如下：

7、(1)接种人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)于细胞工厂，使用mscs无血清抗老化培养基；

8、(2)观察mscs呈短细小梭形状、大小均一、胞体丰满、成螺旋样生长，且汇合度达85％左右时，接种人脐血hscs并更换共培养细胞培养液，建立低氧环境。

9、进一步地，所述人脐带mscs采用组织块法提取得到，人脐血hscs采用磁珠分选法制备得到。

10、进一步地，所述mscs无血清抗老化培养基主要成分为：基础无血清培养基dmem；其余添加组分及浓度：100u/ml青霉素、100mg/l链霉素、3u/ml的肝素及2.5％的多能复合因子。

11、进一步地，所述mscs接种密度为4000-5000/cm2，hscs以1-4×105/ml的密度接种。

12、一种如上所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养体系在体外扩增人脐血长期造血干细胞的用途。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

14、(1)通过使用无血清基础培养基并添加聚乙烯醇，一方面可以在维持干性的基础上促进hscs的扩增，另一方面促进间充质干细胞的增殖和细胞因子的分泌，进一步促进了hscs的体外培养。

15、(2)低氧和烟酰胺对造血干细胞培养具有协同增效作用，促进造血干细胞的增殖，维持造血干细胞的干性，从而提高了干细胞移植的成功率，提高了疾病的治愈率。

16、(3)本发明解决了现有技术中存在的造血干细胞扩增率低、易分化等缺陷，使cd34+造血干细胞扩增倍数达到将近300倍；且扩增后得到的cd34+cd38-cd45ra-cd49f+cd90+长期造血干细胞群比cd34+细胞群具有更高的扩增倍数，甚至能达到350倍左右。

17、(4)氧在人体内发挥重要生理作用，各组织氧浓度一般不超过13％，骨髓中氧浓度在1％至7％之间，显著低于目前细胞体外培养模式大气中21％氧浓度，而研究表明暴露于高氧环境中不适合hscs正常的增殖分化；本发明建立低氧环境培养hscs，可促进其正常增殖。

18、(5)以基质细胞为滋养层的体外扩增系统，特别是mscs，能够促进原始细胞的体外扩增。本发明以mscs与hscs共培养，mscs不但产生外泌体、微泡等来避免干细胞分化，还能大大促进hscs的增殖。

19、(6)本发明使用的细胞因子scf、flt3-l和tpo是hscs在体外培养所必需的，scf为mscs分泌的糖蛋白，应用scf进行hscs体外培养可有效减少凋亡率；tpo是一方面可通过延长hscs的细胞周期维持其稳定性，另一方面也可促进hscs产生及扩增，并可促进其迁徙归巢；flt3与其配体flt3-l结合可影响hscs生长、分化及凋亡，并可显著提高hscs体外培养扩增的效率。

20、(7)本发明使用的nam作为sirt1的抑制剂，可以阻止hscs分化并促进hscs的扩增。

21、(8)本发明使用3d培养方法，使得mscs可以被包裹在pva聚合物溶液中，通过交联形成水凝胶，水凝胶再与细胞外基质蛋白，如纤维连接蛋白、胶原、层粘连蛋白或糖胺聚糖混合，以允许mscs的附着，形成一正向促mscs生长模式。水凝胶使整个培养体系形成一类似骨髓的多孔海绵状结构，不仅提高了mscs所分泌细胞因子的水平，而且加强了hscs与mscs的直接接触。

技术特征：

1.一种人脐血长期造血干细胞体外扩增培养体系，其特征在于，所述体系包括以人脐带mscs与人脐血hscs利用添加聚乙烯醇及烟酰胺的共培养细胞培养液，在低氧环境下进行共同培养；

2.根据权利要求1所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养体系，其特征在于，所述低氧环境的建立方法为：将氮气与二氧化碳两种气体同时通入培养箱中，用测氧仪测定培养箱内氧气的浓度保持在1-5％，同时维持二氧化碳浓度为5％。

3.一种如权利要求1或2所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养体系的培养方法，其特征在于，步骤如下：

4.根据权利要求3所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养方法，其特征在于，所述人脐带mscs采用组织块法提取得到，人脐血hscs采用磁珠分选法制备得到。

5.根据权利要求3所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养方法，其特征在于，所述mscs无血清抗老化培养基主要成分为：基础无血清培养基dmem；其余添加组分及浓度：100u/ml青霉素、100mg/l链霉素、3u/ml的肝素及2.5％的多能复合因子。

6.根据权利要求3所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养方法，其特征在于，所述mscs接种密度为4000-5000/cm2，hscs以1-4×105/ml的密度接种。

7.一种如权利要求1或2所述的人脐血长期造血干细胞体外扩增培养体系在体外扩增人脐血长期造血干细胞的用途。

技术总结
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐血长期造血干细胞体外扩增培养方法和体系。本发明主要解决了大量扩增脐血源性LT‑HSCs的技术难点，使用MSCs无血清抗老化培养基，接种MSCs于细胞工厂，待MSCs汇合度达85％左右时，接种人脐血HSCs并更换至共培养细胞培养液，调节氧气浓度至1‑5％即可大量扩增。本发明提供了一种以低氧共培养模式为基础的，辅助添加聚乙烯醇及烟酰胺的高效扩增造血干细胞的体外扩增体系。本发明扩增后得到的CD34+CD38‑CD45RA‑CD49f+CD90+长期造血干细胞群具有更高的扩增倍数，甚至能达到350倍左右。

技术研发人员：王宏伟,崔燕妮,任颜
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16