用于目标等位基因多态性位点扩增、检测的方法和试剂与流程

本发明属于等位基因多态性检测，具体涉及一种用于目标等位基因多态性位点扩增、检测的方法和试剂。

背景技术：

1、等位基因多态性(allelic polymorphism,ap)广泛存在于各物种基因组中并与各种性状相关联，可广泛用于遗传疾病诊断、药物开发使用、作物育种以及品种纯度鉴定等领域。等位基因多态性检测中，一般通过pcr手段对多态性位点进行富集，再结合其他手段对富集产物进行检测。as-pcr是等位基因多态性检测的主要技术手段，其关键是在多态性位点处设计引物，该引物3’端的碱基与多态性位点的特定基因型互补，当且仅当存在该基因型时，引物才可匹配并延伸。可在前述引物上设计与荧光探针互补的标签序列，将特定基因型与特定荧光信号对应，即可通过检测荧光信号确定多态性位点是否存在并进一步确定多态性位点基因型。

2、使用基于荧光信号的as-pcr进行等位基因多态性检测，具有准确、快速、高通量、低成本、无污染、设备要求低及易操作的优势。但在实际应用中，仍会出现非特异扩增，干扰多态性的判定。以基于荧光信号的as-pcr检测为例进行具体说明。图1为根据检出结果绘制的等位基因分型示意图，各坐标轴数值为荧光信号相对值，即探针所带荧光基团释放的荧光信号绝对值与背景荧光信号绝对值的倍数，灰色圆点所示为阴性对照。对于一个等位基因多态性位点g/a，设计基因型g使用fam荧光检测(对应x轴，fam荧光信号相对值)、基因型a使用hex荧光检测(对应y轴，hex荧光信号相对值)。理论上，gg纯合样本检出信号应落在x轴上或附近(图中d所示)，但在实际检测中，其信号值会偏离x轴(图中c所示)，其原因在于非特异性扩增导致检出hex信号造成该纯合样本检测信号的偏移。同理，理论上aa纯合样本检出信号应落在y轴上或附近(图中a所示)，但在实际检测中，其信号值会偏离y轴(图中b所示)。因此，纯合基因型检测信号相对坐标轴的偏离程度可以反应pcr扩增的特异性。此外，对于杂合基因型ga，其检测信号位于两种纯合基因型信号之间。也就是说，如果非特异性扩增较强，势必会对分型判断造成影响。

3、另外，现有技术的各种等位基因多态性检测方法通常对核酸样本的要求较高，与利用粗提法获取的核酸样本兼容性有限。使用核酸粗提液进行检测通常会导致等位基因多态性分型结果变差甚至无法分型。

技术实现思路

1、针对现有技术中等位基因多态性检测存在的非特异扩增和核酸样本要求高的问题，本发明旨在建立一种用于等位基因多态性位点扩增方法，并利用该方法实现等位基因多态性的特异性、高灵敏度检测。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

3、本发明第一方面提供了一种用于目标等位基因多态性位点的扩增方法，具体为：利用样本核酸、第一引物、第二引物和第三引物进行扩增反应，且至少发生以下三种扩增反应：

4、反应一，第一引物和第二引物以样本核酸为模板扩增得到第一产物，第一产物为包含目标等位基因多态性位点的片段；

5、反应二，第二引物和第三引物以样本核酸或/和第一产物为模板扩增得到第二产物，第三引物包括5’部分、中间部分和3’部分，其中5’部分和3’部分分别与模板互补配对，3’端位于目标等位基因多态性位点处，且中间部分包含标签序列；

6、反应三，第一引物和第四引物以样本核酸或/和第一产物为模板扩增得到第三产物，其中第四引物为第二产物变性所得的与第一引物方向相对的单链。

7、优选地，还发生有以下扩增反应：反应四，第一引物和第二引物以第三产物为模板扩增获得第三产物。

8、优选地，所有反应在同一反应体系中进行。

9、在本发明的扩增方法中，所述样本核酸可以为基因组dna、质粒dna、dna片段、rna、dna或rna类似物、dna或rna修饰衍生物等。其中，基因组dna包括核基因组、细胞器基因组；dna片段可通过各种技术手段获得，例如通过物理方法、酶切方法将基因组dna打断获得dna片段，又如通过pcr扩增、探针捕获富集特定dna片段。样本核酸的原始形态不做限制，例如单链核酸、双链核酸，又如线性核酸、环状核酸。样本核酸的来源不做限制，包括但不限于动物(人及其他动物)、植物、细菌、真菌、病毒。可采取本领域已知的方法对样本核酸进行分离、抽提，特别的可使用粗提法对核酸进行分离、抽提，例如可采取碱煮法、酶解法、sds法、ctab法、酚抽提法、异硫氰酸胍法或它们的组合进行核酸分离和/或抽提。对获得的样本核酸可直接用于扩增，也可进一步使用本领域已知的方法进行纯化，例如可采取磁珠法、渗透膜法、乙醇或异丙醇沉淀法或它们的组合进行核酸纯化。此外，也可使用市售试剂或试剂盒对样本核酸进行分离、抽提和/或纯化。

10、在本发明的扩增方法中，根据pcr反应原理可知，每个反应中实现扩增的引物对在模板上的匹配方向需相对，也就是说，反应一和四中的第一引物和第二引物、反应二中的第三引物和第二引物、反应三中的第一引物和第四引物，在反应模板上的匹配方向均是相对的。

11、在本发明的扩增方法中，反应一用于扩增和富集包含目标等位基因多态性位点所在的片段(即第一产物)。相较于样本核酸，第一产物长度短且含量高，故在反应体系中以第一产物作为反应二、反应三的模板或模板之一，更有利于扩增反应的起始。同理，若在同一反应体系中进行多种反应，各引物更易与第一产物结合进行扩增。另外，相较于第三引物，第一引物和第二引物结构简单，在合适反应温度下会进行高效扩增。

12、根据反应一的目的可知，第一引物、第二引物应分别位于目标等位基因多态性位点的两侧。本领域技术人员可以在第一引物和/或第二引物的5’端添加人工序列，例如接头、barcode、index等，进而实现步骤s1中的扩增方法与其他技术的结合，例如，添加测序接头后可使用测序技术对扩增产物进行检测。

13、在本发明的扩增方法中，反应二用于实现目标等位基因多态性位点的特异性扩增，并将第三引物中的标签序列引入第二产物中。

14、反应二具体有两种情况：①第二引物和第三引物以样本核酸为模板扩增得到第二产物；②第二引物和第三引物以第一产物为模板扩增得到第二产物。由此可见，在步骤s1的反应体系中，反应一与反应二之间并不存在明确的先后顺序。在一具体情形中，反应一、反应二可均以样本核酸为模板，同时，反应一在先反应二在后、或反应二在先反应一在后的进行。在另一具体情形中，反应一以样本核酸为模板先进行，反应二以第一产物为模板后进行。在又一具体情形中，反应一、反应二先均以样本核酸为模板进行，待产生第一产物后，反应二同时也以第一产物为模板进行。也就是说，在本发明的反应体系中，不论反应一、反应二所使用的模板以及反应先后顺序，只要获得相应的第一产物、第二产物即可。

15、反应二所用的第三引物由5’部分、中间部分、3’部分组成。5’部分、3’部分可分别与模板(即样本核酸和/或第一产物)通过碱基互补配对进行结合；所述互补配对只要求5’部分和3’部分能与模板稳定结合即可，对互补配对程度不做要求。中间部分与样本核酸不匹配，且包含标签序列。当第三引物的5’部分、3’部分与模板结合时，对形成的具体结构不做限制。在一具体情形中，5’部分和3’部分与模板毗邻区域结合，第三引物的结构如图2a(凸环结构)、2b(茎环结构)所示。在另一具体情形中，5’部分、3’部分与模板非毗邻区域结合，第三引物的结构如图2c(非对称内环结构)所示。

16、优选地，第三引物的5’部分和3’部分与模板100％互补配对。

17、优选地，第三引物的中间部分除了标签序列外，还包含其他人工序列。如在图2b所示，中间部分除了标签序列外，中间部分的两端进一步包括了两段反向互补序列，使得中间部分形成茎环结构。

18、在设计反应二所用的第三引物时，第三引物与模板结合的位置应在第一引物和第二引物分别与模板结合的位置之间，且第三引物的3’末端需位于目标等位基因多态性位点处，即第三引物3’端的最末一个碱基与目标等位基因多态性位点特定基因型相匹配。

19、另外，对第三引物所包含的标签序列长度不做限制。而且，在同一反应体系中，若包含多条第三引物，每条第三引物的标签序列可以长度一致，也可以长短不一，具有高特异性即可。

20、在本发明的扩增方法中，反应三巧妙的利用第二产物3’端的可延伸性，实现目标等位基因多态性位点的进一步扩增。与第二产物相同，第三产物同样为带有标签序列的目标等位基因多态性位点的扩增产物。反应三可仅以样本核酸为模板，也可仅以第一产物为模板，还可以同时以样本核酸、第一产物为模板。

21、优选地，可通过延长第三引物5’部分(即增加第四引物3’端与模板结合的碱基数)和/或增加循环数等手段，提升反应三的扩增效率。

22、在本发明的扩增方法中，对于步骤s1中实现反应一、二、三的扩增方式没有具体要求，只要能生成第二产物和第三产物即可。在实际操作中，可采取变温扩增方式的三步法、两步法，也可采取等温扩增方式进行。各反应可分别具有相同或不同的最佳反应温度。在具体实施时，既可采取快速变温方式，又可采取touch down、touch up的方式。以第一反应反应温度高于第二反应为例，可以先使用第一反应适合的退火温度进行多轮扩增，再使用第二反应适合的退火温度进行多轮扩增；还可以先使用第一反应适合的退火温度进行多轮扩增，再采取touch down的方式边扩增边降至第二反应适合的退火温度，然后在第二反应适合的退火温度进行多轮扩增。

23、优选地，选择反应一的退火温度高于反应二的扩增温度的扩增方式。

24、需要注意的是，在本发明的扩增方法中，第一引物、第二引物、第三引物、第一产物、第二产物、第三产物均为概括性描述，具体可为一种、两种或多种。例如，一种第一引物、两种第一引物、多种第一引物。又如，一种第一产物、两种第一产物、多种第一产物。基于此，利用本发明提供的扩增方法，可以实现一个或多个多态性位点的特异性扩增，例如：

25、a)对一个多态性位点的一种特定基因型进行扩增。

26、具体操作为：反应一，由一种第一引物与一种第二引物扩增，获得第一产物；反应二，由一种第三引物与上述第二引物扩增，获得第二产物，或者该种第三引物与上述第二引物组合无法扩增，无第二产物；反应三，若存在第二产物，则由上述第一引物与第四引物扩增，获得第三产物。

27、以等位基因多态性位点g/a为例，仅对该多态性位点的一种特定基因型g进行扩增。若样本核酸在此多态性位点为纯合g，经第一引物与第二引物扩增后，将获得一种第一产物；在反应二中，根据特定基因型g设计的第三引物与第二引物组合进行扩增，获得第二产物；反应三中，第一引物与第四引物组合进行扩增，获得第三产物。若样本核酸在此多态性位点为杂合，经第一引物与第二引物扩增后，将获得两种第一产物(可以理解的是，两种第一产物仅在多态性位点处存在差异)；在反应二中，根据特定基因型g设计的第三引物可与第二引物组合进行扩增，获得一种第二产物；反应三中，第一引物与第四引物组合进行扩增，获得一种第三产物。若样本在此多态性位点为纯合a，经第一引物与第二引物扩增后，将获得一种第一产物；在反应二中，根据特定基因型g设计的第三引物无法与第二引物组合进行扩增，无第二产物；进而反应三也无法进行。

28、b)对单个多态性位点的两种基因型进行扩增。

29、具体操作为：反应一，由一种第一引物与一种第二引物扩增，获得第一产物；反应二，由两种第三引物与一种第二引物扩增，获得一种或两种第二产物；第三反应，由上述第一引物与第四引物扩增，获得一种或两种第三产物。

30、以等位基因多态性位点g/a为例，对该多态性位点的两种基因型g、a进行扩增。若样本核酸在此多态性位点为纯合g，经第一引物与第二引物扩增后，将获得一种第一产物；在反应二中，根据特定基因型g设计的第三引物与第二引物组合进行扩增，获得一种第二产物；反应三中，第一引物与第四引物组合进行扩增，获得一种第三产物。若样本核酸在此多态性位点为杂合，经第一引物与第二引物扩增后，将获得两种第一产物，且两种第一产物仅在多态性位点处存在差异；在反应二中，根据特定基因型g设计的第三引物可与第二引物组合进行扩增，获得一种第二产物，根据特定基因型a设计的第三引物可与第二引物组合进行扩增，获得另一种第二产物；反应三中，第一引物分别与两种第四引物组合进行扩增，获得两种第三产物。若样本在此多态性位点为纯合a，经第一引物与第二引物扩增后，将获得一种第一产物；在反应二中，根据特定基因型a设计的第三引物与第二引物组合进行扩增，获得一种第二产物；反应三中，第一引物与第四引物组合进行扩增，获得一种第三产物。

31、c)对多个多态性位点的多种基因型进行扩增。

32、以两个多态性位点对应的四种基因型扩增为例，参照b)，可理解为单个多态性位点的两种基因型扩增方案的叠加。因此，其具体操作可以为：反应一，由两种第一引物与两种第二引物扩增(即两对引物分别对应两个多态性位点扩增)，获得第一产物；反应二，由四种第三引物与两种第二引物组合扩增，获得第二产物；反应三，由两种第一引物与一种或多种第四引物组合扩增，获得第三产物。需要注意的是，在上述反应中，需克服各引物之间的相互干扰。

33、另外，在本发明方法中，多态性位点的类型没有限制，可为snp、也可为indel。例如，snp型多态性位点g/a；又如indel型多态性位点g/-(“-”代表缺失碱基)、g/gt(t为插入碱基)。

34、可以理解的是，在本发明的方法中，不同类型的多态性位点的差别主要体现在第三引物3’端碱基的设计上。为便于本领域技术人员理解，本发明对indel型多态性位点的第三引物进行举例说明：以5’-t[g/-]a-3’为例，扩增基因型g的第三引物3’端碱基为c(与基因型g互补配对)，扩增缺失基因型“-”的第三引物3’端碱基为t(与后一位a互补配对)；以5’-t[g/gt]a-3’为例，扩增基因型g的第三引物3’端碱基为t(与后一位a互补配对)，扩增基因型gt的第三引物3’端碱基为a(与插入碱基t互补配对)。

35、在本发明的扩增方法中，实现了标签序列与目标多态性位点的特定基因型的关联。基于此，本发明第二方面提供了一种用于目标等位基因多态性位点的检测方法，具体为：利用标签序列，对第二产物和/或第三产物进行检测，以确定多态性位点处的碱基信息。其中，检测方法包括但不限于荧光探针法、酶联免疫法、侧向层析法等。

36、优选地，采用荧光探针法进行检测。

37、采用荧光探针法进行检测时，需向反应体系中加入淬灭状态的荧光探针。荧光探针既可以在扩增反应开始前加入，即随扩增反应体系的其他成分一起加入；又可以在扩增反应结束后加入，即于扩增产物中加入荧光探针。本发明对荧光信号的收集不做限制，既可以在扩增产物生成过程中进行荧光信号收集，也可仅在扩增产物稳定后进行荧光信号收集。另外，在本发明的同一反应体系中，不同的荧光探针可以长度一致，也可以长短不一，具有高特异性、相互不干扰即可。

38、荧光探针基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,fret)进行设计，其原理为：当荧光基团和淬灭基团足够靠近(<100a)时，荧光基团受激发产生的发射光被淬灭基团吸收，无法检测到荧光基团的荧光信号；当荧光基团与淬灭基团被分隔开，荧光基团的发射光无法被淬灭基团吸收，可检测到荧光基团的荧光信号。

39、本发明设计荧光探针所使用的荧光基团可以为现有技术中任意荧光基团及其组合。当同一体系中使用多种荧光基团时，所使用的各荧光基团的激发波长、发射波长需存在区别，以便荧光信号的准确识别。本发明可选的荧光基团包括但不限于alexa fluor 350、pacific blue、marina blue、cascade blue、acridine、edans、coumarin、bodipy 493/503、cy 2、bodipy fl、fluorescein、dan-syl、alexa fluor 488、alexa fluor 488-x、fam、oregon green 514、rhodamine green、rhodol green、rhodamine green-x、tet、alexafluor 430、cal fluor gold 540、joe、yakima yellow、rhodamine 6g、vic、alexa fluor532、bodipy 530/550、hex、cal fluor orange 560、alexa fluor 555、bodipy 558/569、quasar 570、bodipy 564/570、bodipy tmr、cy 3、alexa fluor 546、tamra、rhodaminered-x、bodipy 576/589、cal fluor red 590、bodipy 581/591、bodipy fl-x、bodipy r6g-x、rhodamine red、cy 3.5、rox、texas red、texas red-x、alexa fluor 568、cal fluorred 610、bodipy tr-x、alexa fluor 594、alexa flouor635、alexa flouor 660、alexaflouor 750、bodipy 630/650、bodipy 650/665、cy 5、quasar670、alexa fluor 647、cy5.5、cy 7。本发明可选的淬灭基团包括但不限于bhq-1、bhq-2、tamra、dabcyl、ddq-1。

40、更为优选地，本发明所用荧光探针为单链结构或5’茎环结构。

41、当荧光探针为单链结构时，荧光基团、淬灭基团分别标记在单链两端，因单链结构的柔性特征，荧光基团与淬灭基团接近，无可检测的荧光信号，荧光探针处于淬灭状态；检测时，荧光探针与标签序列结合，单链结构探针参与形成刚性特征的双链结构，使得荧光基团与淬灭基团分开，产生可检测的荧光信号。

42、当荧光探针为5’茎环结构时，荧光基团和淬灭基团分别标记在不同茎端，荧光基团与淬灭基团接近，无可检测的荧光信号，荧光探针处于淬灭状态；检测时，荧光探针与标签序列结合，5’茎环结构探针结合后茎环结构打开，使得荧光基团与淬灭基团分开，产生可检测的荧光信号。

43、需要说明的是，荧光探针与标签序列的结合可以是序列的全部互补配对，还可以是部分互补配对，仅需存在使得两者稳定结合的足够长度的序列即可。例如，全部荧光探针序列与全部标签序列的结合；又如，部分荧光探针序列与全部标签序列的结合；再如，全部荧光探针序列与部分标签序列的结合。

44、在本发明的检测方法中，扩增反应产生的第二产物、第三产物均含有标签序列，故荧光探针可与第二产物、第三产物或者含有第二产物、第三产物的混合产物结合，进而激发可检测的荧光信号。具体的，本发明将荧光探针与第二产物结合产生的荧光信号称为第一荧光信号，将荧光探针与第三产物结合产生的荧光信号称为第二荧光信号。因此，荧光探针与含有第二产物、第三产物的混合产物结合，可产生第一荧光信号以及第二荧光信号。

45、在本发明的检测方法中，还产生了第三荧光信号，具体为：当荧光探针与第三产物结合时，第一引物可在探针上游启动扩增，当扩增至荧光探针结合位置时，聚合酶所具有的外切酶活性将荧光探针水解，荧光基团与淬灭基团分开，产生可检测的荧光信号，即第三荧光信号。

46、基于本发明提供的检测方法，本发明第三方面提供了一种检测试剂盒，该试剂盒至少包含以下物质：

47、第一引物，结合在目标等位基因多态性位点的上游；

48、第二引物，结合在目标等位基因多态性位点的下游；

49、第三引物，包括5’部分、中间部分和3’部分，其中5’部分和3’部分分别与模板互补配对，3’端位于目标等位基因多态性位点处，且中间部分包含标签序列；

50、淬灭状态的荧光探针，能与标签序列结合；

51、其中，第一引物与第二引物组合用以扩增产生第一产物，第三引物与第二引物组合用以产生第二产物；

52、以第二产物变性所得且与第一引物方向相对的单链为第四引物，并与第一引物组合用以产生第三产物。

53、本发明第四方面提供了上述检测试剂盒在确定多态性位点是否存在和/或多态性位点基因型中的应用。具体为：通过第一引物、第二引物和第三引物按照本发明扩增方法对样本核酸扩增，将标签序列与特定多态性位点的特定基因型进行关联，再通过荧光探针检测标签序列的有无、标签序列的类型即可实现确定多态性位点是否存在、多态性位点的具体基因型。

54、例如，使用本发明扩增方法对等位基因多态性位点g/a的特定基因型g进行扩增，并使用荧光探针法进行等位基因多态性检测，基因型g使用fam荧光检测；若检出fam荧光，则可判断该多态性位点存在基因型g，可为纯合基因型g也可为杂合基因型；若未检出fam荧光信号，则可判断该多态性位点不存在基因型g，仅可为纯合基因型a。又如，使用本发明扩增方法对等位基因多态性位点g/a的两种基因型进行扩增，并使用荧光探针法进行等位基因多态性检测，其中基因型g使用fam荧光检测、基因型a使用hex荧光检测；若仅检出fam荧光信号，则可判断该多态性位点基因型为纯合基因型g；若仅检出hex荧光信号，则可判断该多态性位点基因型为纯合基因型a；若同时检出fam、hex荧光信号，则可判断该多态性位点基因型为杂合基因型。

55、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

56、(1)特异性强。其原因之一在于，反应二、反应三均可以第一产物为模板进行，相较于直接在样本核酸的基因组或大片段上进行，降低了扩增难度；原因之二在于，第四引物具有高特异性，第四引物来自于第二产物变性后的单链，长度长且带有标签序列；原因之三在于，第二产物、第三产物均引入了标签序列，且将标签序列与目标多态性位点的特定基因型进行了关联。也就是说，将原有多态性位点中1个或几个碱基的差异，扩大至了十几或几十标签序列的差异，并且通过多个反应进行了富集，特异性大幅提高。

57、(2)灵敏度高。在反应二、反应三、反应四中，均实现了多态性位点的富集，为后续多态性位点的检测提供基础。使用荧光探针对多态性位点进行检测时，最多可有三次荧光信号的叠加；其中，第一荧光信号、第二荧光信号来源于荧光探针与第二产物和/或第三产物的结合，第三荧光信号来自于荧光探针与第三产物结合后的水解。多态性位点的多次扩增、检测信号的多次叠加可大幅提升检测的灵敏度。

58、(3)适用于核酸粗提液。鉴于扩增特异性的增强、灵敏度的提高，扩增反应对作为原始模板的样本核酸要求降低，可很好的与核酸粗提液兼容，且可获得较好的多态性扩增、检测结果。

59、(4)扩大了可检测的多态性位点范围。多态性位点竞争引物的可选范围非常小，主要是因为其3’末端必须为对应的多态性位点；在传统as-pcr中，当多态性位点处于复杂结构处时，竞争引物可能扩增效率低甚至无法扩增，只能放弃对该多态性位点的扩增及检测。本发明特异性强、灵敏度高的特性，实现了可检测的多态性位点的广覆盖。