一种基于KASP技术的大豆SNP标记组合及其在品种鉴定中的应用

本发明属于生物，具体涉及一种基于kasp技术的大豆snp标记组合及其在品种鉴定中的应用。

背景技术：

1、大豆(glycine max(l.)merr.)是豆科大豆属的一年生草本植物。大豆籽粒富含蛋白质和脂肪，是我国居民食用植物蛋白和植物油脂的重要来源，大豆籽粒中还含有丰富的异黄酮、低聚糖、卵磷脂等保健功能性物质成分，具有较高的营养价值和经济价值。大豆起源于中国，栽培大豆的种植历史已有5000余年。随着大豆育种工作的迅速开展，近年来大批高产优质高抗的大豆新品种得到广泛推广和种植。但是，经过多年驯化，祖先亲本和骨干亲本的遗传背景相对狭窄，导致不同大豆品种的亲缘关系接近，给品种鉴定增加了难度。另外，种子销售市场上也存在同名异物或异物同名所致的品种真实性问题，随之而来的品种权纠纷时有发生。

2、目前常用的品种鉴定方法是形态学鉴定，通过田间种植待测品种和近似品种，利用形态指标(如花色、叶形、株高、粒型等)进行比对鉴定品种的特异性与真实性。但是由于性状指标有限，品种间形态差异不明显，使得这类鉴定方法的区分能力有限，且鉴定工作量繁重、周期较长、受环境季节影响较大、鉴定结果存在一定的主观误差。

3、随着分子生物学的发展，分子标记技术已经广泛的应用于种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、基因定位和辅助育种中。传统的基于dna多态性的分子标记主要有rflp、rapd、aflp和ssr。rflp、rapd和aflp位点有限、实验操作繁琐且稳定性差，不适合进行广泛应用。目前最为常用的是具有共显性特征的ssr标记，该种标记的多态性丰富、成本低、操作简便，常规分子生物学实验室中均可开展。但是，ssr标记存在无法一次性检测大批量样本，通量较低，不同实验室间电泳数据较难共享等缺陷。

4、随着高通量测序技术的快速发展，水稻、玉米、大豆等主要农作物的全基因组序列陆续公布和完善，基于单核苷酸变异开发的snp标记逐渐成为应用广泛的分子标记。snp具有分布广泛均匀、位点密度高、变异丰富、通量高、不同平台间一致性良好等优点。snp芯片是一类高通量的snp标记集合产品，该技术将大量已知序列探针集成在同一个基片(如玻片、膜)或液态系统中，通过探针杂交、荧光信号检测、结果扫描分析等手段对个体基因型进行快速高效的分析。目前大豆中已经开发的芯片有美国农业部开发的soysnp50k固态芯片、韩国开发的180k axiomtm soyasnp商业性固态芯片、南京农业大学开发的njau 355ksoysnp固态芯片、中国农科院开发的illumina中豆芯一号固态芯片，以及博瑞迪公司开发的soy10ksnp液相芯片。snp芯片通量较高，一次可检测10k以上的位点，但是芯片的检测依赖二代测序技术，需要特定平台，常规实验室无法实现自行检测，检测成本较高。

5、竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(kompetitive allele specific pcr，kasp)是一种基于snp的新型基因分型技术，可从基因组水平对snp进行精准分型。lcg公司研发的intelliqube平台通过超高的单日检测反应数(＞4万个数据点)和极小的反应体系(低至1.6μl)，极大降低了检测成本，通过结合全自动一体化dna抽提、荧光定量pcr平台，实现snp位点的快速检测。与snp芯片相比，kasp标记检测目标性强、分辨率高、操作简便快捷、检测成本低、易于在常规实验室中开展实现。因此，kasp标记是目前实现品种鉴定和真实性检测的理想分子标记。在大豆中开发一套低密度高分辨率的kasp标记组合，不仅丰富了大豆分子标记，也可应用于大豆品种基因分型、品种鉴定，有利于对大豆种质资源和品种进行科学规范的管理。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于kasp技术的大豆snp标记组合及其在品种鉴定中的应用。

2、第一方面，本发明要求保护大豆基因组中60个snp位点在如下任一中的应用：

3、(1)制备大豆snp位点检测试剂盒；

4、(2)对大豆种质资源或遗传群体进行基因分型；

5、(3)构建大豆种质资源或品种dna指纹图谱。

6、所述60个snp位点的物理位置是基于大豆品种williams 82的全基因组序列对比确定的，所述大豆品种williams 82的全基因组序列的版本号为glyma.wm82.a1；所述60个snp位点是kasp01-kasp60；

7、kasp01位于1号染色体上第4311728位，其脱氧核苷酸为c或g；

8、kasp02位于1号染色体上第28616975位，其脱氧核苷酸为a或g；

9、kasp03位于1号染色体上第55754037位，其脱氧核苷酸为t或c；

10、kasp04位于2号染色体上第815811位，其脱氧核苷酸为t或g；

11、kasp05位于2号染色体上第28837063位，其脱氧核苷酸为c或t；

12、kasp06位于2号染色体上第49781104位，其脱氧核苷酸为t或c；

13、kasp07位于3号染色体上第9908482位，其脱氧核苷酸为a或t；

14、kasp08位于3号染色体上第22177520位，其脱氧核苷酸为c或t；

15、kasp09位于3号染色体上第46233843位，其脱氧核苷酸为c或t；

16、kasp10位于4号染色体上第4141655位，其脱氧核苷酸为c或a；

17、kasp11位于4号染色体上第17513985位，其脱氧核苷酸为t或c；

18、kasp12位于4号染色体上第43068656位，其脱氧核苷酸为g或a；

19、kasp13位于5号染色体上第1235681位，其脱氧核苷酸为t或a；

20、kasp14位于5号染色体上第19239946位，其脱氧核苷酸为a或g；

21、kasp15位于5号染色体上第40386592位，其脱氧核苷酸为c或g；

22、kasp16位于6号染色体上第1609551位，其脱氧核苷酸为c或t；

23、kasp17位于6号染色体上第16293204位，其脱氧核苷酸为a或t；

24、kasp18位于6号染色体上第45427416位，其脱氧核苷酸为a或t；

25、kasp19位于7号染色体上第675371位，其脱氧核苷酸为t或a；

26、kasp20位于7号染色体上第18906873位，其脱氧核苷酸为a或g；

27、kasp21位于7号染色体上第42885466位，其脱氧核苷酸为g或a；

28、kasp22位于8号染色体上第5706471位，其脱氧核苷酸为a或g；

29、kasp23位于8号染色体上第29222122位，其脱氧核苷酸为c或t；

30、kasp24位于8号染色体上第46187026位，其脱氧核苷酸为g或a；

31、kasp25位于9号染色体上第4894003位，其脱氧核苷酸为g或a；

32、kasp26位于9号染色体上第25986741位，其脱氧核苷酸为a或g；

33、kasp27位于9号染色体上第45981018位，其脱氧核苷酸为a或t；

34、kasp28位于10号染色体上第621510位，其脱氧核苷酸为a或t；

35、kasp29位于10号染色体上第28549514位，其脱氧核苷酸为t或c；

36、kasp30位于10号染色体上第49396430位，其脱氧核苷酸为t或g；

37、kasp31位于11号染色体上第6779604位，其脱氧核苷酸为a或g；

38、kasp32位于11号染色体上第15603095位，其脱氧核苷酸为t或c；

39、kasp33位于11号染色体上第38814323位，其脱氧核苷酸为g或a；

40、kasp34位于12号染色体上第228048位，其脱氧核苷酸为c或t；

41、kasp35位于12号染色体上第12437656位，其脱氧核苷酸为c或g；

42、kasp36位于12号染色体上第39553554位，其脱氧核苷酸为t或c；

43、kasp37位于13号染色体上第6900485位，其脱氧核苷酸为a或t；

44、kasp38位于13号染色体上第20849041位，其脱氧核苷酸为g或a；

45、kasp39位于13号染色体上第43199174位，其脱氧核苷酸为t或c；

46、kasp40位于14号染色体上第2058465位，其脱氧核苷酸为t或c；

47、kasp41位于14号染色体上第28733885位，其脱氧核苷酸为t或c；

48、kasp42位于14号染色体上第47152568位，其脱氧核苷酸为a或c；

49、kasp43位于15号染色体上第7674176位，其脱氧核苷酸为g或t；

50、kasp44位于15号染色体上第29695518位，其脱氧核苷酸为t或c；

51、kasp45位于15号染色体上第50324633位，其脱氧核苷酸为c或a；

52、kasp46位于16号染色体上第2386736位，其脱氧核苷酸为t或a；

53、kasp47位于16号染色体上第26052190位，其脱氧核苷酸为a或g；

54、kasp48位于16号染色体上第35302123位，其脱氧核苷酸为t或a；

55、kasp49位于17号染色体上第667612位，其脱氧核苷酸为t或c；

56、kasp50位于17号染色体上第26480391位，其脱氧核苷酸为c或t；

57、kasp51位于17号染色体上第39648339位，其脱氧核苷酸为g或a；

58、kasp52位于18号染色体上第549139位，其脱氧核苷酸为t或c；

59、kasp53位于18号染色体上第35052320位，其脱氧核苷酸为t或g；

60、kasp54位于18号染色体上第57323340位，其脱氧核苷酸为c或t；

61、kasp55位于19号染色体上第1940662位，其脱氧核苷酸为c或t；

62、kasp56位于19号染色体上第29664121位，其脱氧核苷酸为a或g；

63、kasp57位于19号染色体上第49676448位，其脱氧核苷酸为c或t；

64、kasp58位于20号染色体上第993796位，其脱氧核苷酸为g或t；

65、kasp59位于20号染色体上第18540182位，其脱氧核苷酸为c或g；

66、kasp60位于20号染色体上第45632820位，其脱氧核苷酸为c或t。

67、第二方面，本发明要求保护一种成套kasp引物。

68、本发明所要求保护的成套kasp引物为用于检测前文第一方面中所述60个snp位点的kasp引物。

69、每个待测snp位点对应的kasp引物均分别包括两条正向引物和一条反向引物；其中两条正向引物分别记作正向引物1和正向引物2；所述正向引物1为在特异性引物1的5'末端连接一种荧光标签序列后所得，所述正向引物2为在特异性引物2的5'末端连接另一种荧光标签序列后所得；所述反向引物为通用引物。

70、用于检测kasp01的所述特异性引物1由seq id no.1的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.61的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.121所示核苷酸组成；

71、用于检测kasp02的所述特异性引物1由seq id no.2的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.62的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.122所示核苷酸组成；

72、用于检测kasp03的所述特异性引物1由seq id no.3的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.63的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.123所示核苷酸组成；

73、用于检测kasp04的所述特异性引物1由seq id no.4的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.64的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.124所示核苷酸组成；

74、用于检测kasp05的所述特异性引物1由seq id no.5的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.65的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.125所示核苷酸组成；

75、用于检测kasp06的所述特异性引物1由seq id no.6的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.66的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.126所示核苷酸组成；

76、用于检测kasp07的所述特异性引物1由seq id no.7的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.67的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.127所示核苷酸组成；

77、用于检测kasp08的所述特异性引物1由seq id no.8的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.68的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.128所示核苷酸组成；

78、用于检测kasp09的所述特异性引物1由seq id no.9的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.69的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.129所示核苷酸组成；

79、用于检测kasp10的所述特异性引物1由seq id no.10的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.70的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.130所示核苷酸组成；

80、用于检测kasp11的所述特异性引物1由seq id no.11的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.71的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.131所示核苷酸组成；

81、用于检测kasp12的所述特异性引物1由seq id no.12的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.72的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.132所示核苷酸组成；

82、用于检测kasp13的所述特异性引物1由seq id no.13的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.73的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.133所示核苷酸组成；

83、用于检测kasp14的所述特异性引物1由seq id no.14的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.74的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.134所示核苷酸组成；

84、用于检测kasp15的所述特异性引物1由seq id no.15的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.75的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.135所示核苷酸组成；

85、用于检测kasp16的所述特异性引物1由seq id no.16的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.76的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.136所示核苷酸组成；

86、用于检测kasp17的所述特异性引物1由seq id no.17的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.77的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.137所示核苷酸组成；

87、用于检测kasp18的所述特异性引物1由seq id no.18的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.78的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.138所示核苷酸组成；

88、用于检测kasp19的所述特异性引物1由seq id no.19的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.79的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.139所示核苷酸组成；

89、用于检测kasp20的所述特异性引物1由seq id no.20的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.80的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.140所示核苷酸组成；

90、用于检测kasp21的所述特异性引物1由seq id no.21的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.81的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.141所示核苷酸组成；

91、用于检测kasp22的所述特异性引物1由seq id no.22的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.82的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.142所示核苷酸组成；

92、用于检测kasp23的所述特异性引物1由seq id no.23的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.83的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.143所示核苷酸组成；

93、用于检测kasp24的所述特异性引物1由seq id no.24的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.84的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.144所示核苷酸组成；

94、用于检测kasp25的所述特异性引物1由seq id no.25的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.85的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.145所示核苷酸组成；

95、用于检测kasp26的所述特异性引物1由seq id no.26的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.86的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.146所示核苷酸组成；

96、用于检测kasp27的所述特异性引物1由seq id no.27的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.87的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.147所示核苷酸组成；

97、用于检测kasp28的所述特异性引物1由seq id no.28的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.88的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.148所示核苷酸组成；

98、用于检测kasp29的所述特异性引物1由seq id no.29的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.89的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.149所示核苷酸组成；

99、用于检测kasp30的所述特异性引物1由seq id no.30的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.90的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.150所示核苷酸组成；

100、用于检测kasp31的所述特异性引物1由seq id no.31的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.91的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.151所示核苷酸组成；

101、用于检测kasp32的所述特异性引物1由seq id no.32的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.92的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.152所示核苷酸组成；

102、用于检测kasp33的所述特异性引物1由seq id no.33的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.93的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.153所示核苷酸组成；

103、用于检测kasp34的所述特异性引物1由seq id no.34的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.94的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.154所示核苷酸组成；

104、用于检测kasp35的所述特异性引物1由seq id no.35的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.95的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.155所示核苷酸组成；

105、用于检测kasp36的所述特异性引物1由seq id no.36的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.96的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.156所示核苷酸组成；

106、用于检测kasp37的所述特异性引物1由seq id no.37的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.97的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.157所示核苷酸组成；

107、用于检测kasp38的所述特异性引物1由seq id no.38的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.98的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.158所示核苷酸组成；

108、用于检测kasp39的所述特异性引物1由seq id no.39的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.99的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.159所示核苷酸组成；

109、用于检测kasp40的所述特异性引物1由seq id no.40的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.100的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.160所示核苷酸组成；

110、用于检测kasp41的所述特异性引物1由seq id no.41的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.101的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.161所示核苷酸组成；

111、用于检测kasp42的所述特异性引物1由seq id no.42的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.102的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.162所示核苷酸组成；

112、用于检测kasp43的所述特异性引物1由seq id no.43的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.103的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.163所示核苷酸组成；

113、用于检测kasp44的所述特异性引物1由seq id no.44的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.104的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.164所示核苷酸组成；

114、用于检测kasp45的所述特异性引物1由seq id no.45的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.105的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.165所示核苷酸组成；

115、用于检测kasp46的所述特异性引物1由seq id no.46的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.106的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.166所示核苷酸组成；

116、用于检测kasp47的所述特异性引物1由seq id no.47的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.107的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.167所示核苷酸组成；

117、用于检测kasp48的所述特异性引物1由seq id no.48的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.108的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.168所示核苷酸组成；

118、用于检测kasp49的所述特异性引物1由seq id no.49的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.109的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.169所示核苷酸组成；

119、用于检测kasp50的所述特异性引物1由seq id no.50的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.110的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.170所示核苷酸组成；

120、用于检测kasp51的所述特异性引物1由seq id no.51的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.111的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.171所示核苷酸组成；

121、用于检测kasp52的所述特异性引物1由seq id no.52的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.112的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.172所示核苷酸组成；

122、用于检测kasp53的所述特异性引物1由seq id no.53的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.113的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.173所示核苷酸组成；

123、用于检测kasp54的所述特异性引物1由seq id no.54的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.114的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.174所示核苷酸组成；

124、用于检测kasp55的所述特异性引物1由seq id no.55的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.115的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.175所示核苷酸组成；

125、用于检测kasp56的所述特异性引物1由seq id no.56的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.116的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.176所示核苷酸组成；

126、用于检测kasp57的所述特异性引物1由seq id no.57的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.117的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.177所示核苷酸组成；

127、用于检测kasp58的所述特异性引物1由seq id no.58的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.118的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.178所示核苷酸组成；

128、用于检测kasp59的所述特异性引物1由seq id no.59的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.119的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.179所示核苷酸组成；

129、用于检测kasp60的所述特异性引物1由seq id no.60的第22位及以后核苷酸组成，所述特异性引物2由seq id no.120的第22位及以后核苷酸组成，所述反向引物由seqidno.180所示核苷酸组成。

130、在本发明的具体实施方式中，在所述正向引物1中，5'末端连接的荧光标签序列为fam荧光标签序列。

131、在本发明的具体实施方式中，在所述正向引物2中，5'端连接的荧光标签序列为hex荧光标签序列。

132、进一步地，所述fam荧光标签序列如seq id no.1的第1-21位所示；所述hex荧光标签序列如seq id no.2的第1-21位所示。

133、更进一步地，用于检测各snp位点的kasp引物具体如下：

134、用于检测kasp01的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.61所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.121所示；

135、用于检测kasp02的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.62所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.122所示；

136、用于检测kasp03的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.63所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.123所示；

137、用于检测kasp04的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.64所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.124所示；

138、用于检测kasp05的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.65所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.125所示；

139、用于检测kasp06的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.66所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.126所示；

140、用于检测kasp07的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.67所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.127所示；

141、用于检测kasp08的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.68所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.128所示；

142、用于检测kasp09的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.69所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.129所示；

143、用于检测kasp10的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.70所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.130所示；

144、用于检测kasp11的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.71所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.131所示；

145、用于检测kasp12的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.72所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.132所示；

146、用于检测kasp13的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.73所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.133所示；

147、用于检测kasp14的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.74所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.134所示；

148、用于检测kasp15的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.75所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.135所示；

149、用于检测kasp16的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.76所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.136所示；

150、用于检测kasp17的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.17所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.77所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.137所示；

151、用于检测kasp18的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.18所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.78所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.138所示；

152、用于检测kasp19的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.79所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.139所示；

153、用于检测kasp20的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.20所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.80所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.140所示；

154、用于检测kasp21的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.21所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.81所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.141所示；

155、用于检测kasp22的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.22所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.82所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.142所示；

156、用于检测kasp23的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.23所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.83所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.143所示；

157、用于检测kasp24的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.24所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.84所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.144所示；

158、用于检测kasp25的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.25所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.85所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.145所示；

159、用于检测kasp26的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.26所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.86所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.146所示；

160、用于检测kasp27的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.27所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.87所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.147所示；

161、用于检测kasp28的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.28所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.88所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.148所示；

162、用于检测kasp29的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.29所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.89所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.149所示；

163、用于检测kasp30的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.30所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.90所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.150所示；

164、用于检测kasp31的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.31所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.91所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.151所示；

165、用于检测kasp32的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.32所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.92所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.152所示；

166、用于检测kasp33的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.33所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.93所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.153所示；

167、用于检测kasp34的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.34所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.94所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.154所示；

168、用于检测kasp35的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.35所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.95所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.155所示；

169、用于检测kasp36的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.36所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.96所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.156所示；

170、用于检测kasp37的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.37所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.97所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.157所示；

171、用于检测kasp38的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.38所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.98所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.158所示；

172、用于检测kasp39的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.39所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.99所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.159所示；

173、用于检测kasp40的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.40所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.100所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.160所示；

174、用于检测kasp41的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.41所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.101所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.161所示；

175、用于检测kasp42的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.42所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.102所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.162所示；

176、用于检测kasp43的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.43所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.103所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.163所示；

177、用于检测kasp44的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.44所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.104所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.164所示；

178、用于检测kasp45的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.45所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.105所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.165所示；

179、用于检测kasp46的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.46所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.106所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.166所示；

180、用于检测kasp47的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.47所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.107所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.167所示；

181、用于检测kasp48的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.48所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.108所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.168所示；

182、用于检测kasp49的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.49所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.109所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.169所示；

183、用于检测kasp50的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.50所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.110所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.170所示；

184、用于检测kasp51的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.51所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.111所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.171所示；

185、用于检测kasp52的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.52所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.112所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.172所示；

186、用于检测kasp53的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.53所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.113所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.173所示；

187、用于检测kasp54的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.54所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.114所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.174所示；

188、用于检测kasp55的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.55所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.115所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.175所示；

189、用于检测kasp56的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.56所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.116所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.176所示；

190、用于检测kasp57的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.57所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.117所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.177所示；

191、用于检测kasp58的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.58所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.118所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.178所示；

192、用于检测kasp59的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.59所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.119所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.179所示；

193、用于检测kasp60的所述正向引物1的核苷酸序列如seq id no.60所示，所述正向引物2的核苷酸序列如seq id no.120所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.180所示。

194、第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述成套kasp引物的试剂盒。

195、进一步地，所述试剂或试剂盒中还可含有kasp 2×mastermix，mgcl2和ddh2o。

196、所述试剂或试剂盒中kasp 2×mastermix含有荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b。

197、所述荧光探针a的核苷酸序列与所述正向引物1的5'端连接的荧光标签序列的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团a；所述淬灭探针a的核苷酸序列与所述标签序列a的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

198、所述荧光探针b的核苷酸序列与所述正向引物2的5'端连接的荧光标签序列的核苷酸序列一致，5’末端连接荧光基团b；所述淬灭探针b的核苷酸序列与所述标签序列b的核苷酸序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

199、在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团a为fam；所述荧光基团b为hex；所述淬灭基团为bhq。

200、第四方面，本发明要求保护前文第二方面中所述的成套kasp引物或前文第三方面中所述的试剂盒在如下任一中的应用：

201、(1)制备大豆snp位点检测试剂盒；

202、(2)对大豆种质资源或遗传群体进行基因分型；

203、(3)构建大豆种质资源或品种dna指纹图谱。

204、第五方面，本发明要求保护一种对大豆种质资源或遗传群体进行基因分型的方法。

205、本发明要求保护的对大豆种质资源或遗传群体进行基因分型的方法，可包括如下步骤：

206、(a1)分别提取供试大豆种质资源或遗传群体中所有大豆样品的基因组dna；

207、(a2)对(a1)所得供试大豆样品dna，按照前文第一方面中所述60个snp位点，依次配制pcr反应体系，采用前文第二方面所述的成套kasp引物中的相应引物分别进行pcr扩增；

208、(a3)对扩增产物进行荧光扫描，读取和分析荧光信号，从而获得所述供试大豆样品dna在所述60个snp位点的基因分型结果。

209、第六方面，本发明要求保护一种构建大豆种质资源或品种dna指纹图谱的方法。

210、本发明要求保护的构建大豆种质资源或品种dna指纹图谱的方法，可包括如下步骤：提取用于构建dna指纹图谱的所有大豆种质资源或品种的基因组dna，检测前文第一方面中所述60个snp位点的基因型，对每个大豆种质资源或品种在所述60个snp位点的基因型按照位点编号顺序组合排列，形成特异序列，所述特异序列即为大豆种质资源或品种dna指纹图谱。

211、进一步地，检测所述60个snp位点的基因型通过前文第五方面所述方法实现。

212、在本发明的具体实施方式中，所述大豆具体选自表1和表4中所示的大豆。

213、本发明提供了一种用于大豆品种鉴定的kasp标记组合。本发明提供的60个kasp标记位点平均分布于整个大豆基因组上，具有较高的多态性信息量(pic值)和最小等位基因频率(maf值)，并且基因分型结果准确稳定，能够有效的揭示品种之间的差异。本发明提供的利用60个kasp标记进行大豆品种鉴定的方法，操作简单，重现性好，易于实现，成本较低，可以有效提高大豆品种鉴定、真实性检测、dna指纹图谱绘制的准确性和时效性。