激动性CD40抗体的制作方法

本发明涉及与人cd40受体特异性结合并且能够独立于fcγ介导的cd40受体交联而诱导cd40信号传导的人源化单克隆激动性抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及所述抗体和包含它们的药物组合物的用途。

背景技术：

1、最近在癌症免疫治疗方面取得的成功恢复了以下假设：免疫系统可以控制许多(即使不是大多数)癌症，在一些情况下以许多小分子药物所不具备的方式产生持久的反应。激动性cd40单克隆抗体(mab)提供了一种新的治疗选择，它有可能通过各种机制产生抗癌免疫力。

2、cd40是细胞表面分子，是肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族的成员。它在诸如树突细胞、b细胞和单核细胞以及许多非免疫细胞等抗原呈递细胞(apc)上广泛表达，并在一系列肿瘤中表达。

3、cd40的天然配体是cd154，它主要在活化t淋巴细胞的表面上表达，并为免疫应答提供t细胞“帮助”的主要成分：通过cd40在apc上的信号传导在很大程度上介导了辅助t细胞授权apc的能力。例如，cd40在dc上的连接诱导增加共刺激分子和mhc分子的表面表达、促炎性细胞因子的产生以及增强的t细胞触发作用。在静止的b细胞上的cd40连接增加了抗原呈递功能和增殖。

4、cd40信号传导的影响是多方面的，并取决于表达cd40的细胞类型和提供cd40信号的微环境。像tnf受体家族的其他成员一样，cd40信号传导由衔接子分子介导，而不是由cd40胞质尾区的固有信号转导活性介导。受体组装后，下游激酶被激活，多组分信号传导复合体从cd40移位至细胞溶胶中，并激活了几个特征明确的信号转导途径。

5、拮抗人cd40抗体是本领域已知的。相应的拮抗抗体可以是沉默的fc变体，显示出减少的fcγ介导的cd40受体交联。人igg1 fc区的相应的突变描述于例如us2018/0118843中。

6、在最近设计的免疫调节方法中，靶向cd40的激动剂单克隆抗体(mab)用于增强免疫系统识别和破坏癌细胞的能力。相应的临床前研究表明，激动性cd40 mab可以激活apc并促进抗肿瘤t细胞应答，并在缺乏t细胞免疫力的情况下培养具有控制癌症的潜能的细胞毒性髓样细胞。因此，激动性cd40mab根本不同于mab，后者通过阻断如ctla-4或pd-1等的阴性检查点分子来实现免疫激活。

7、cp-870,893是首个完全人igg2 mab，其作为cd40的有效和选择性激动剂。有趣的是，cp-870,893的结合不会与cd154与cd40的结合竞争。在临床前研究中，cp-870,893已显示出介导对肿瘤细胞存活的免疫系统依赖性和非依赖性影响。在首次人类研究中，观察到有希望的抗肿瘤活性，尤其是在黑色素瘤患者中。在药效学上，施用cp-870,893导致外周血b细胞的短暂减少，并导致apc上激活标志物的上调。

8、因此，激动性cd40 mab代表了新型癌症疗法的有希望的策略。然而，关于其潜在的细胞毒性副作用也已经引起了关注。激动性单克隆cd40抗体有望触发细胞因子释放综合征、自身免疫反应、血栓栓塞综合征(由于血小板和内皮细胞表达cd40)、过度免疫刺激导致激活诱导的细胞死亡或耐受性、以及肿瘤血管生成。这些作用可导致不良的毒性或促进肿瘤生长。从机理上讲，在动物研究中，激动性cd40和其他靶向tnf受体家族的抗体与fcγ受体相互作用的能力已经与毒性的发生有关(li&ravetch 2012,xu等人2003,byrne等人2016)。

9、对于检测的最强的激动剂cp-870,893，已报道的最常见的副作用是细胞因子释放综合征，在输注后不久表现为发冷、发烧、僵硬和其他症状。同样，使用cp-870,893还观察到了几例血栓栓塞事件。使用达西妥珠单抗(dacetuzumab)，已经观察到非传染性炎症性眼炎。

10、因此，需要提供激动性cd40 mab，其表现出降低的细胞毒性，导致较少的临床副作用，同时保持其效力和临床有效性。本发明的激动性cd40 mab可以满足该需求，允许利用激动性cd40抗体的全部免疫调节潜力。

技术实现思路

1、本发明提供与人cd40受体特异性结合并独立于fcγ介导的cd40受体交联而诱导cd40信号传导的单克隆抗体或其抗原结合片段。更具体地，本发明的抗体结合与cd40配体的表位重叠的cd40表位，并能够激活人apc。本发明还提供包含所述抗体的组合物，以及该抗体和组合物在治疗期望刺激免疫系统的病症或疾病中的用途，例如，在患有癌症的患者的治疗中。

2、定义

3、术语“抗体”涵盖抗体结构的各种形式，包括但不限于整个抗体和抗体片段，只要其显示出根据本发明的特性即可。

4、“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

5、如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一氨基酸组合物的抗体分子的制剂。

6、术语“人源化抗体”或“抗体的人源化形式”是指由于抗体工程化而使重链和轻链均被人源化的抗体。人源化链通常是这样的链，其中v区氨基酸序列已改变，因此从整体上分析，其与人种系序列的同源性比与来源物种的种系序列的同源性更近。人源化评估是基于所得的氨基酸序列，而不是基于方法本身。

7、如本文所用，术语“针对靶标或抗靶标抗体特异性结合”是指通过elisa测定的、抗体与相应抗原(靶标)或抗原表达细胞的结合，其中所述elisa优选包括以下：包被相应的抗原至固相支持物，在允许与相应的抗原或蛋白质形成免疫复合体的条件下添加所述抗体，使用与本发明所述的抗体结合的二抗通过测定光密度值(od)来检测所述免疫复合体，并使用过氧化物酶介导的显色。

8、根据本发明的术语“抗原”是指用于免疫的抗原或包含所述抗原作为其蛋白质序列的一部分的蛋白质。例如，为了免疫，可以使用蛋白质的胞外结构域的片段(例如前20个氨基酸)，并且对于检测/测定等，可以使用蛋白质或全长蛋白质的胞外结构域。

9、本文中的术语“特异性结合”或“特异性识别”是指抗体对抗原表现出明显的亲和力，并且优选地，不表现出明显的交叉反应性。

10、“不表现出明显的交叉反应性”的抗体是不会明显结合至不希望的其他蛋白质的抗体。可以根据本领域公知的用于确定这种结合的任何方法来确定特异性结合，例如，通过竞争性结合测定如elisa。

11、“与相同表位结合的抗体”作为参考抗体是指在竞争测定中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％以上的抗体，相反，在竞争测定中参考抗体阻断抗体与其抗原的结合达50％以上。

12、如本文所用，“根据本发明的抗体的可变区(或结构域)”(轻链的可变区(vl)，重链的可变区(vh))表示直接参与抗体与抗原结合的该对轻链和重链区中的每一个。可变轻链区和重链区具有相同的一般结构，并且每个区均包含四个框架(fr)区，它们的序列是广泛保守的，通过三个互补决定区cdr连接。

13、当在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合部分”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分优选包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基。cdr序列是根据kabat等人,sequences of proteins of immunological interest，第5版publichealth service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)定义的。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或额外的氨基酸，其对应于可变区的fr或cdr的缩短或插入。例如，重链可变区可以包括在h2的残基52之后单个氨基酸插入(根据kabat的残基52a)和在重链fr残基82之后的插入的残基(例如，根据kabat的残基82、，82b和82c等)。对于给定抗体，残基的kabat编号可以通过在抗体序列与“标准”kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定。

14、“恒定结构域(恒定部分)”不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出例如还有效应子功能。对应于人igg1的重链恒定区基因片段称为γ1链。对应于人igg3的重链恒定区基因片段称为γ3链。人恒定的γ重链在kabat,e.a等人,sequences of proteins ofimmunological interest,第5版,public health service,national institutes ofhealth,bethesda,md.(1991)和brueggemann,m.等人,j.exp.med.166(1987)1351-1361；love,t.w.等人,methods enzymol.178(1989)515-527中详细描述。

15、本文中的术语“fc区”用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的c末端区域。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。

16、除非本文另有说明，否则fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据eu编号系统(也称为eu索引)进行的，如kabat等人,sequences of proteins of immunologicalinterest,第5版.public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991)所述。

17、“变体fc区”包含由于本文定义的至少一个“氨基酸修饰”而不同于“天然”或“野生型”序列fc区的氨基酸序列。

18、如本文所用，术语“fc变体”是指在fc结构域中包含修饰的多肽。该修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。变体可以包含非天然氨基酸。

19、术语“含fc区的多肽”是指包含fc区的多肽，例如抗体。

20、术语“fc受体”或“fcr”用于描述与抗体的fc区结合的受体。结合igg抗体的fcr(γ受体)包括fcyri、fcyrii和fcyriii亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选择地剪接形式。fcyrii受体包括fcyriia(“激活受体”)和fcyriib(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，其主要区别在于其胞质结构域。活化受体fcyriia在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。抑制受体fcyriib在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)(参见daeron,m.,annu.rev.immunol.15(1997)203-234中的综述)。fcr在ravetch和kinet,annu.rev.immunol 9(1991)457-492；capel等人,immunomethods 4(1994)25-34；和de haas等人,j.lab.clin.med.126(1995)330-41中进行综述。其他fcr，包括将来要鉴定的那些，由本文中的术语“fcr”所涵盖。该术语还包括新生儿受体fcrn，它负责将母体igg转移至胎儿(guyer等人,j.immunol.117(1976)587和kim等人,j.immunol.24(1994)249)。

21、如本文所用，“igg fc配体”是指来自任何生物的分子，优选多肽，其结合至igg抗体的fc区以形成fc/fc配体复合体。fc配体包括但不限于fcyr、fcrn、clq、c3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白a、链球菌蛋白g和病毒fcyr。fc配体还包括fc受体同源物(fcrh)，其是与fcyr同源的fc受体家族(davis等人,immunological reviews 190(2002)123-136,通过引用整体并入)。fc配体可包括未发现的结合fc的分子。特定的igg fc配体是fcrn和fcγ受体。如本文所用，“fc配体”是指来自任何生物的分子，优选多肽，其结合至抗体的fc区以形成fc/fc配体复合体。

22、如本文所用，“fcγ受体”、“fcyr”或“fcγr”是指结合igg抗体fc区并由fcyr基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人中，该家族包括但不限于fcyri(cd64)，包括同工型fcyria、fcyrib和fcyric；fcyrii(cd32)，包括同工型fcyriia(包括同种异型h131和r131)、fcyriib(包括fcyriib-1和fcyriib-2)、和fcyriic；和fcyriii(cd 16)，包括同工型fcyriiia(包括同种异型v158和f158)和fcyriiib(包括同种异型fcyriib-na1和fcyriib-na2)(jefferis等人,immunol lett 82(2002))，以及任何未发现的人fcyr或fcyr同种型或同种异型。fcyr可以来自任何生物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔子和猴子。小鼠fcyr包括但不限于fcyri(cd64)、fcyrii(cd32)、fcyriii(cd 16)和fcyriii-2(cd 16-2)，以及任何未发现的小鼠fcyr或fcyr同种型或同种异型。

23、如本文所用，“fcrn”或“新生儿fc受体”是指结合igg抗体fc区并且至少部分由fcrn基因编码的蛋白质。fcrn可以来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴子。如本领域已知的，功能性fcrn蛋白包含两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由fcrn基因编码。除非本文另有说明，否则fcrn或fcrn蛋白是指fcrn重链与β-2-微球蛋白的复合体。

24、在比对序列并引入空位后(如有必要)，将相对于肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，以实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以以本领域技术范围内的多种方式，例如，使用公开可用的计算机软件，例如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件来实现。

25、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“adcc”是指细胞介导的反应，其中表达fcr的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞的裂解。用于介导adcc的主要细胞nk细胞仅表达fcyriii，而单核细胞表达fcyri、fcyrii和fcyriii。造血细胞上的fcr表达总结于ravetch和kinet,annu.rev.immunol 9(1991)457-492的第464页的表3中。

26、术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”和“adcp”是指将抗体包被的细胞通过结合至免疫球蛋白fc区的吞噬性免疫细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)进行全部或部分内化的过程。

27、如本文所用，术语“一种或多种抗体效应子功能”或“效应子功能”是指由igg的一个或多个fc效应子结构域(例如，免疫球蛋白的fc区)贡献的功能。此类功能可通过例如将一个或多个fc效应子结构域与具有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的fc受体结合或通过将一个或多个fc效应子结构域与补体系统的组分结合来影响。典型的效应子功能是adcc、adcp和cdc。

28、“c1q”是包括免疫球蛋白fc区结合位点的多肽。c1q与两个丝氨酸蛋白酶c1r和c1s一起形成复合体c1，这是补体依赖性细胞毒性(cdc)途径的第一组分。

29、抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体主要分为五类：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

30、试剂例如药物制剂的“有效量”是指在所需剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防效果的量。

31、如本文所用，术语“癌症”可以是例如肺癌、非小细胞肺癌(nscl)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、晚期胰腺癌皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、肠胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统肿瘤(cns)、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、包括上述任何一种癌症的难治性形式(refractory version)，或一种或多种上述癌症的组合。