一种乌鳢下丘脑神经元原代细胞的分离和培养方法

本发明属于鱼类原代细胞分离和培养，具体涉及一种乌鳢下丘脑神经元原代细胞的分离和培养方法。

背景技术：

1、乌鳢，俗称黑鱼、乌鱼等。属鲈形目，鳢科，鳢属，是一种凶猛的肉食性淡水鱼。2022年我国乌鳢产量约55.32万吨，与其他淡水鱼相比，黑鱼具有出肉率高、蛋白质和其他营养成分含量高、疗效多样等优点。相比其他鱼类，乌鳢存在摄食率低等问题，乌鳢的营养学研究是提升乌鳢养殖经济效益的关键。

2、细胞是生命的基础和出发点，也是生命科学的前沿和聚焦点。细胞联系着发育、神经、营养等重要研究学科。细胞试验能更深层次揭示病理和营养机制，其不仅展现的是本试验动物的生化机制，更能透射出甚至跨越物种的参考价值。近年鱼类细胞研究兴起，类比哺乳动物和其他鱼类的研究发现，鱼类下丘脑可能是控制摄食的关键，通过研究鱼类下丘脑细胞可能是提高乌鳢摄食率，增加乌鳢养殖产业甚至整个水产养殖业经济效益的关键。

3、目前鱼类脑细胞的分离方法常用酶消化法和组织贴壁法，存在以下缺陷：

4、(1)酶消化法消化时间不好把控，并且可能存在少量影响原代细胞贴壁和生长的杂细胞，但获得的细胞细胞量大贴壁基点多，生长快，原代细胞培养周期短。

5、(2)组织贴壁法操作简洁，但组织贴壁基点少，延展慢，且培养状态不美观。

6、目前尚未有乌鳢下丘脑细胞原代提取和培养方法的报道。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种乌鳢下丘脑神经元原代细胞的分离和培养方法，以解决酶消化法存在的问题以及乌鳢下丘脑体积过小难以去除覆膜和血管导致杂细胞过多抑制神经元细胞贴壁问题。

2、为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：

3、本发明提供一种乌鳢下丘脑神经元原代细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：

4、步骤(1)，将乌鳢浸泡于75％酒精中消毒，剪开乌鳢脑室，剪断脊髓，翻出大脑腹面，用镊子夹出垂体两侧的两瓣下丘脑至于dpbs中清洗去血液等杂质；

5、步骤(2)，将清洗后的下丘脑转移至aim消毒液中使用精细镊子剥离大部分下丘脑覆膜和血管组织，而后转移至新的aim中室温下静置消毒；

6、步骤(3)，将消毒后的下丘脑置于ⅰ型胶原酶消化液中剪碎，置于慢速摇床上室温消化，随后加入原代细胞培养液终止消化；

7、步骤(4)，将消化结束的下丘脑组织细胞混合液转移至离心管中吹吸打散组织块，而后离心弃去上清，用原代培养液重悬接种于六孔板中；

8、步骤(5)，使用差速贴壁法获得贴壁的乌鳢下丘脑神经元细胞，在含二氧化碳培养箱中培养21d，得到乌鳢下丘脑神经元原代细胞。

9、优选地，所述步骤(2)中的aim消毒液是以l-15培养液为基础添加两性霉素b溶液、硫酸庆大霉素溶液和青链霉素双抗溶液制备而成，其中两性霉素b溶液、硫酸庆大霉素溶液和青链霉素双抗溶液的质量比为(1-10)：1：(1-10)；优选地，所述两性霉素b溶液、硫酸庆大霉素溶液和青链霉素双抗溶液的添加量分别为aim消毒液的5％、1％和5％；所述aim消毒液中两性霉素b溶液和硫酸庆大霉素溶液的浓度分别为(200-300)μg/ml和(25-75)mg/ml，优选地所述aim消毒液中两性霉素b溶液和硫酸庆大霉素溶液的浓度分别为250μg/ml和50mg/ml；优选地，配制硫酸庆大霉素溶液所使用的硫酸庆大霉素含量为(500-700)iu/mg，更优选地为590iu/mg。

10、优选地，步骤(1)中酒精消毒时间为3-5min；步骤(2)中消毒时间为1-3h，优选地为1.5h。

11、优选地，所述步骤(3)中的ⅰ型胶原酶消化液为以l-15培养液为基础、添加10xⅰ型胶原酶母液和青链霉素双抗溶液配制，现配现用；其中10xⅰ型胶原酶母液和青链霉素双抗溶液的质量比为(5-15)：1，优选地，10xⅰ型胶原酶母液和青链霉素双抗溶液的添加量分别为ⅰ型胶原酶消化液的10％和1％。

12、优选地，所述10xⅰ型胶原酶母液为ⅰ型胶原酶和dpbs按100mg:10ml配置，-20℃保存。

13、优选地，步骤(2)和步骤(3)中的室温为20℃-26℃。

14、优选地，步骤(3)中的消化时间为0.5-1.5h，优选地为1h。

15、优选地，所述步骤(3)中的原代细胞培养液为以l-15为基础添加胎牛血清和青链霉素双抗溶液配制，其中所述胎牛血清和青链霉素双抗溶液的质量比为(10-30)：1，优选地，所述胎牛血清和青链霉素双抗溶液的添加量分别为原代细胞培养液的20％和1％。

16、优选地，所述步骤(4)中的离心转速为1200r/min，离心5min；所述步骤(5)中的培养箱的温度为28℃，二氧化碳含量为3％。

17、优选地，所述步骤(5)中，差速贴壁法是接种六孔板后6-12h将未贴壁的细胞及培养液吸到空孔中并在原孔中添加新培养液的操作，此操作重复3-5次；所述步骤(5)中，培养过程中每3-5d换一次液，第21d细胞长满六孔板的至少80％。

18、上述l-15培养液(meilunbio)、两性霉素b(meilunbio)、硫酸庆大霉素(meilunbio)、青链霉素双抗溶液(meilunbio)、ⅰ型胶原酶(solarbio)、dpbs(meilunbio)、胎牛血清(cell-box)均购于市面。其中，青链霉素双抗溶液中青霉素g钠盐含和硫酸链霉素的含量分别为10ku/ml和10mg/ml，ⅰ型胶原酶效价≥125units/mg。

19、现有技术相比，本发明的有益效果在于：

20、(1)本发明提供的方法使用酶消化法配合差速贴壁法，降低了剔除小体积乌鳢下丘脑覆膜和血管的精细操作，利用差速贴壁法去除了难以剥离的覆膜和血管，从而获得高纯度的贴壁乌鳢下丘脑神经元细胞；

21、(2)本发明提供的方法得到的乌鳢原代下丘脑神经元细胞的纯度高、细胞状态好、贴壁美观、传代周期短；

22、(3)本发明提供的方法得到的乌鳢下丘脑神经元原代细胞为乌鳢营养学、疾病学、生物学等领域的深入研究提供了有利条件；

23、(4)本发明提供的方法为开展乌鳢各方面研究提供了重要基础，尤其为研究乌鳢细菌性疾病和摄食刺激机制提供了良好的研究样本，可促进乌鳢养殖产业快速发展，同时响应健康养殖号召，并且为其他鱼类下丘脑神经元细胞原代培养提供重要参考。

技术特征：

1.一种乌鳢下丘脑神经元原代细胞的分离和培养方法，其特征是，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的aim消毒液是以l-15培养液为基础添加两性霉素b溶液、硫酸庆大霉素溶液和青链霉素双抗溶液制备而成，其中两性霉素b溶液、硫酸庆大霉素溶液和青链霉素双抗溶液的质量比为(1-10)：1：(1-10)；优选地，所述两性霉素b溶液、硫酸庆大霉素溶液和青链霉素双抗溶液的添加量分别为aim消毒液的5％、1％和5％；所述aim消毒液中两性霉素b溶液和硫酸庆大霉素溶液的浓度分别为(200-300)μg/ml和(25-75)mg/ml，优选地所述aim消毒液中两性霉素b溶液和硫酸庆大霉素溶液的浓度分别为250μg/ml和50mg/ml；优选地，配制硫酸庆大霉素溶液所使用的硫酸庆大霉素含量为(500-700)iu/mg，更优选地为590iu/mg。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中酒精消毒时间为3-5min；步骤(2)中消毒时间为1-3h，优选地为1.5h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的ⅰ型胶原酶消化液为以l-15培养液为基础、添加10xⅰ型胶原酶母液和青链霉素双抗溶液配制，现配现用；其中10xⅰ型胶原酶母液和青链霉素双抗溶液的质量比为(5-15)：1，优选地，10xⅰ型胶原酶母液和青链霉素双抗溶液的添加量分别为ⅰ型胶原酶消化液的10％和1％。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述10xⅰ型胶原酶母液为ⅰ型胶原酶和dpbs按100mg:10ml配置，-20℃保存。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中的室温为20℃-26℃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的消化时间为0.5-1.5h，优选地为1h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的原代细胞培养液为以l-15为基础添加胎牛血清和青链霉素双抗溶液配制，其中所述胎牛血清和青链霉素双抗溶液的质量比为(10-30)：1，优选地，所述胎牛血清和青链霉素双抗溶液的添加量分别为原代细胞培养液的20％和1％。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的离心转速为1200r/min，离心5min；所述步骤(5)中的培养箱的温度为28℃，二氧化碳含量为3％。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，差速贴壁法是接种六孔板后6-12h将未贴壁的细胞及培养液吸到空孔中并在原孔中添加新培养液的操作，此操作重复3-5次；所述步骤(5)中，培养过程中每3-5d换一次液，第21d细胞长满六孔板的至少80％。

技术总结
本发明属于鱼类原代细胞分离和培养技术领域，具体涉及一种乌鳢下丘脑神经元原代细胞的分离和培养方法。本发明提供的方法使用酶消化法配合差速贴壁法，降低了剔除小体积乌鳢下丘脑覆膜和血管的精细操作，利用差速贴壁法去除了难以剥离的覆膜和血管，从而获得高纯度的贴壁乌鳢下丘脑神经元细胞；本发明提供的方法得到的乌鳢原代下丘脑神经元细胞的纯度高、细胞状态好、贴壁美观、传代周期短。

技术研发人员：陈秀梅,林允杰,李明泽,吴雪芹,王桂芹,金笑延
受保护的技术使用者：吉林农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15