一种引物组合物及试剂盒的制作方法

本申请涉及核酸检测，尤其涉及一种引物组合物及试剂盒。

背景技术：

1、在流行性感冒病例日益增多的现在，国内针对甲型流感病毒（infa）的检测方法常见有病毒分离培养、抗原检测和核酸检测，其中，病毒分离培养的准确性高，但是成本也高，操作复杂，检测时间久，很难在临床大规模的展开；抗原检测时间短，设备要求低，操作简单，但是灵敏度较低，容易出现漏检情况；核酸检测的灵敏度和特异性高，但是设备要求高，需要在实验室中由专业人员操作；现有的这些检测方法无法兼顾检测效率和灵敏度，检测过程也十分复杂。

技术实现思路

1、针对上述现有技术中存在的问题，本申请提供了一种引物组合物及试剂盒，能够简单快速地检测出甲型流感病毒，且不易发生漏检，提升检测效率和检测灵敏度。所述技术方案如下：

2、本申请提供了一种引物组合物，包括用于检测甲型流感病毒的第一引物组；

3、所述第一引物组包括如seq id no.1所示的上游引物、如seq id no.2所示的下游引物、如seq id no.3所示的上游内引物和如seq id no.4所示的下游内引物；

4、所述引物组合物能够基于环介导等温扩增反应进行检测。

5、进一步地，所述第一引物组还包括如seq id no.5所示的上游环状引物和如seqid no.6所示的下游环状引物。

6、进一步地，所述第一引物组中的上游环状引物通过荧光基团标记，所述第一引物组中的下游环状引物通过淬灭基团修饰；

7、所述荧光基团包括vic荧光基团、fam荧光基团与rox荧光基团中的至少一种；

8、所述淬灭基团包括tamra淬灭基团、biotin淬灭基团与mgb淬灭基团中的至少一种。

9、进一步地，所述引物组合物还包括用于检测人源内参actb基因的第二引物组，

10、所述第二引物组包括如seq id no.7所示的上游引物、如seq id no.8所示的下游引物、如seq id no.9所示的上游内引物和如seq id no.10所示的下游内引物。

11、进一步地，第二引物组还包括如seq id no.11所示的上游环状引物和如seq idno.12所示的下游环状引物。

12、进一步地，所述第二引物组中的上游环状引物通过荧光基团标记，所述第二引物组中的下游环状引物通过淬灭基团修饰；

13、所述荧光基团包括vic荧光基团、fam荧光基团与rox荧光基团中的至少一种；

14、所述淬灭基团包括tamra淬灭基团、biotin淬灭基团、digoxigenin淬灭基团与mgb淬灭基团中的至少一种。

15、本申请还提供了一种试剂盒，包括裂解液和环介导等温扩增反应组合物，所述环介导等温扩增反应组合物包括如上任一项所述的引物组合物，所述裂解液用于裂解样本，得到核酸提取液；所述环介导等温扩增反应组合物用于与所述核酸提取液进行环介导等温扩增反应，得到扩增产物。

16、进一步地，所述试剂盒满足下述特征中的至少其一：

17、第一引物组的上游引物、下游引物、上游内引物、下游内引物、上游环状引物和下游环状引物中至少其一的浓度为1~25μmol/l；

18、第二引物组的上游引物、下游引物、上游内引物、下游内引物、上游环状引物和下游环状引物中至少其一的浓度为1~25μmol/l。

19、进一步地，所述裂解液包括100~300nm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1%~0.3%的非离子表面活性剂，余量为无核酸酶水。

20、进一步地，所述环介导等温扩增反应组合物还包括50~150nm硫酸镁、300~700mm氯化钾、60~120mm硫酸铵、700pm~1000pm dntp 预混物、80u~220u酶预混物和50pm~200pm甜菜碱，余量为无核酸酶水。

21、进一步地，所述试剂盒还包括金标试纸条，所述金标试纸条包括底板、样品垫、金标垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、所述金标垫、所述层析膜和所述吸水垫设置于所述底板上；

22、所述样品垫位于所述底板上的一端，所述金标垫的一端与所述样品垫连接，所述金标垫的另一端与所述层析膜连接，所述层析膜的另一端与所述吸水垫连接，所述吸水垫位于所述底板上的另一端；

23、所述样品垫用于吸收扩增产物；

24、所述层析膜包被有质控线和至少一条检测线。

25、进一步地，所述检测线上包被有bio单克隆抗体和dig单克隆抗体中的至少一种；

26、所述质控线上包被有羊抗鸡igy抗体；

27、所述金标垫上包被有胶体金标记的fam单克隆抗体与鸡igy抗体。

28、进一步地，所述试剂盒针对甲型流感病毒的最低检测限为20~150copies/μl。

29、实施本申请，具有如下有益效果：

30、1、本申请采用针对甲型流感病毒的第一引物组，通过该第一引物组中的上游引物、下游引物、上游内引物和下游内引物对甲型流感病毒进行扩增和检测，能够简单快速地检测出甲型流感病毒，对甲型流感病毒的检测特异性高；并且，该引物组合物基于环介导等温扩增反应进行检测，检测快速，操作简便，灵敏度高，不易发生漏检，使得针对甲型流感病毒的检测效率、检测灵敏度和检测便利性都得到了极大的提升，也大大提升检测准确性和检测结果可靠性。

31、2、该引物组合物采用上游环状引物和下游环状引物，能够极大地加快样本中靶标基因的扩增效率，缩短反应时间，进一步提升该引物组合物及试剂盒对甲型流感病毒的检测效率。

32、3、采用针对人源内参actb基因的第二引物组，能够在检测过程中确认针对甲型流感病毒的样本采样以及检测过程中裂解反应和环介导等温扩增反应等是否成功完成，配合第一引物组进一步提升甲型流感病毒检测结果的可信度。

33、4、该试剂盒基于环介导等温扩增反应进行扩增，对检测条件要求较低；并且采用金标试纸条进行检测结果判读，甲型流感病毒呈阴性或者呈阳性的检测结果判读简单准确，无需专业人员操作，使用难度大大降低。

技术特征：

1.一种引物组合物，其特征在于，包括用于检测甲型流感病毒的第一引物组和用于检测人源内参actb基因的第二引物组；

2. 根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述第一引物组还包括如seq idno.5所示的上游环状引物和如seq id no.6所示的下游环状引物。

3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，所述第一引物组中的上游环状引物通过荧光基团标记，所述第一引物组中的下游环状引物通过淬灭基团修饰；

4. 根据权利要求1-3任一项所述的引物组合物，其特征在于，所述第二引物组还包括如seq id no.11所示的上游环状引物和如seq id no.12所示的下游环状引物。

5.根据权利要求4所述的引物组合物，其特征在于，所述第二引物组中的上游环状引物通过荧光基团标记，所述第二引物组中的下游环状引物通过淬灭基团修饰；

6.一种试剂盒，其特征在于，包括裂解液和环介导等温扩增反应组合物，所述环介导等温扩增反应组合物包括如权利要求1-5任一项所述的引物组合物，所述裂解液用于裂解样本，得到核酸提取液；所述环介导等温扩增反应组合物用于与所述核酸提取液进行环介导等温扩增反应，得到扩增产物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒满足下述特征中的至少其一：

8.根据权利要求6-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括100~300nm的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1%~0.3%的非离子表面活性剂，余量为无核酸酶水。

9. 根据权利要求6-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增反应组合物还包括50~150nm硫酸镁、300~700mm氯化钾、60~120mm硫酸铵、700pm~1000pm dntp 预混物、80u~220u酶预混物和50pm~200pm甜菜碱，余量为无核酸酶水。

10.根据权利要求6-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括金标试纸条，所述金标试纸条包括底板（1）、样品垫（2）、金标垫（3）、层析膜（4）和吸水垫（5），所述样品垫（2）、所述金标垫（3）、所述层析膜（4）和所述吸水垫（5）设置于所述底板（1）上；

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述检测线上包被有bio单克隆抗体和dig单克隆抗体中的至少一种；

12.根据权利要求6-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒针对甲型流感病毒的最低检测限为20~150copies/μl。

技术总结
本申请公开了一种引物组合物及试剂盒，包括用于检测甲型流感病毒的第一引物组；所述第一引物组包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物、如SEQ ID NO.3所示的上游内引物和如SEQ ID NO.4所示的下游内引物；所述引物组合物能够基于环介导等温扩增反应进行检测。本申请通过第一引物组的上游引物、下游引物、上游内引物和下游内引物对甲型流感病毒进行扩增，能够简单快速地检测出甲型流感病毒，对甲型流感病毒的检测特异性高；且该引物组合物基于环介导等温扩增反应进行检测，检测快速，操作简便，灵敏度高，不易发生漏检，使得针对甲型流感病毒的检测效率、检测灵敏度和检测便利性都得到了提升，也提升检测准确性和检测结果可靠性。

技术研发人员：何伟,薛良,陈世兴,韩思超,郏肯特,韩云波
受保护的技术使用者：上海格诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8