一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法与流程

本发明涉及探针磁珠，具体为一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法。

背景技术：

1、传统的羧基修饰磁珠，受限于磁珠表面积、磁珠表面电场力影响、磁珠表面羧基官能团的均匀程度及活化程度，单链脱氧核糖核酸探针仅仅能较为充分地捕获高表达量的rna分子，对于中低表达量的rna分子不能有效捕获，由此会引起rna定量不准确的问题。

技术实现思路

1、本发明所解决的技术问题在于提供一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，以解决技术背景中所提到的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，具体包括以下步骤：

2、(1)、取传统羧基修饰的磁珠10万个，在1.5ml ep塑料管中应用1.5mlph 5.0的100mm mes缓冲液吹打冲洗3次；

3、(2)、使用磁力架吸附磁珠，弃掉上清后，磁珠沉淀应用1ml活化缓冲液在22℃充分震荡1h；

4、(3)、使用磁力架吸附磁珠，弃掉上清后，应用磁珠清洗液清洗磁珠3次；

5、(4)、使用磁力架吸附磁珠，加入1ml的pamam g5树枝状聚合物，在室温条件下缓慢震荡过夜；

6、(5)、使用磁力架吸附磁珠，弃掉上清后，应用磁珠清洗液清洗磁珠3次；

7、(6)、使用磁力架吸附磁珠，弃掉上清后，应用双性接枝缓冲液重悬磁珠，在室温条件下缓慢震荡1h；

8、(7)、使用磁力架吸附磁珠，弃掉上清后，磁珠沉淀应用1ml连接缓冲液在22℃充分震荡过夜；

9、(8)、使用磁力架吸附磁珠，弃掉上清后，应用磁珠清洗液清洗磁珠3次；

10、(9)、完成以上反应的磁珠，保存在无菌的无核酸酶水中。

11、优选地，所述(2)中活化缓冲液包含以下成分：500ul的ph 5.0100mm mes缓冲液、500ul 0.1g/ml edc。

12、优选地，所述磁珠清洗液为：ph 7.4pbs+0.05％tween-20。

13、优选地，所述(6)中双性接枝缓冲液为10mm双琥珀酰亚胺辛二酸酯。

14、优选地，所述(7)中连接缓冲液包含以下成分：900ul的ph 5.0100mm mes缓冲液以及100ul 100mm具有rna捕获能力的探针。

15、与现有技术相比，本方法通过在较稳平缓的条件下，仅仅需要室温及缓慢震荡，应用成本较为低廉的化合物即可，在传统的羧基修饰磁珠表面连接上pamam g5树枝状分级聚合物结构，再通过具有双性双琥珀酰亚胺辛二酸酯作为接头(短杆状结构，两端均具有nhs官能团，可以高效结合氨基官能团)，最终可以实现：磁珠表面每一个羧基官能团，结合一个具有64个氨基官能团的树枝状聚合物结构，而此聚合物的每一个氨基官能团又通过短杆状的双性双琥珀酰亚胺辛二酸酯接头实现64个氨基官能团的结合能力，实现磁珠对于氨基修饰脱氧核糖核酸探针的大规模偶联，提高磁珠对于不同表达量程度rna的整体捕获能力和检测精度。

技术特征：

1.一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，其特征在于，所述(2)中活化缓冲液包含以下成分：500ul的ph 5.0100mm mes缓冲液、500ul 0.1g/mledc。

3.根据权利要求1所述的一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，其特征在于，所述磁珠清洗液为：ph 7.4pbs+0.05％tween-20。

4.根据权利要求1所述的一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，其特征在于，所述(6)中双性接枝缓冲液为10mm双琥珀酰亚胺辛二酸酯。

5.根据权利要求1所述的一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，其特征在于，所述(7)中连接缓冲液包含以下成分：900ul的ph 5.0100mm mes缓冲液以及100ul 100mm具有rna捕获能力的探针。

技术总结
本发明提供了一种用于核酸捕获的高密度探针磁珠制备方法，具体包括以下步骤：取传统羧基修饰的磁珠，在缓冲液冲洗次；使用磁力架吸附磁珠，磁珠沉淀应用活化缓冲液充分震荡；使用磁力架吸附磁珠应用磁珠清洗液清洗磁珠；使用磁力架吸附磁珠，加树枝状聚合物，在室温条件下缓慢震荡过夜；使用磁力架吸附磁珠，应用磁珠清洗液清洗磁珠；使用磁力架吸附磁珠，应用双性接枝缓冲液重悬磁珠，缓慢震荡；使用磁力架吸附磁珠，磁珠沉淀应用连接缓冲液在22℃充分震荡过夜；完成以上反应的磁珠，保存在无菌的无核酸酶水中。本发明提出的方法实现磁珠对于氨基修饰脱氧核糖核酸探针的大规模偶联，提高磁珠对于不同表达量程度RNA的整体捕获能力。

技术研发人员：陈岱,王超,张博
受保护的技术使用者：上海烈冰生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15