用于检测猪圆环4型病毒的引物对及检测方法

本发明涉及生物，具体为一种用于检测猪圆环4型病毒的引物对及检测方法。

背景技术：

1、猪圆环病毒(porcine circovirus,pcv)为圆环病毒科成员。2019年前，全球范围内仅报道过pcv1、pcv2和pcv3三个基因型。pcv1是1974年从猪肾上皮细胞(pk-15)中分离出来的非致病性病毒粒子。pcv2为引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus-associated diseases,pcvad)的主要病原，具有较强的致病性，可致宿主机体的免疫抑制，造成免疫功能低下，临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍和呼吸及消化系统疾病。2016年10月，美国堪萨斯州立大学的palinski r等借助宏基因组测序技术从患病母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出pcv3,证实美国多个州猪群存在pcv3感染。随后,波兰、意大利、韩国等国家相继检测出pcv3。虽然目前关于pcv3致病作用的证据较为匮乏,但普遍认为与pdns、繁殖障碍和多系统炎症存在潜在关联。2019年4月,zhang hh等在中国湖南省的几只临床疾病严重的猪身上发现了-种与其他圆环病毒有明显亲缘关系的新型圆环病毒，并命名为pcv4。pcv4与水貂圆环病毒的核苷酸相似性最高(66.9％)，与其它pcv的核苷酸相似性为43.2％-51.5％。猪圆环病毒4型(pcv4)是新发现的圆环病毒科圆环病毒属的成员。自2019年首次在家猪身上发现pcv4以后，国内外开始陆续报道其研究成果。目前，该病毒已在我国和韩国多省的猪群中传播，欧洲、美洲尚无pcv4阳性病例报道。临床上与pcv3相似，pcv4也与母猪繁殖障碍、猪皮炎和肾病综合征(pdns)、腹泻、呼吸和神经系统病症等存在潜在关联，可能给养猪业带来严重的危害，因此广大研究学者应引起重视。

技术实现思路

1、(一)技术方案

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于crispr-cas12a检测猪圆环4型病毒的引物、探针及检测方法，包括以下操作步骤：

3、(1)组织样品的处理

4、将称取约1g的各组织样品，加入1ml pbs后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；

5、(2)病毒dna的提取

6、(3)引物设计

7、在genbank中检索多株猪圆环病毒4型全基因组序列，通过meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒4型全基因组中高度保守片段cap基因，使用primer premier 5软件，设计cap基因的全长引物，针对猪圆环病毒4型全基因组中高度保守片段cap基因，使用crispr-dt引物设计软件设计猪圆环病毒4型cap基因的crrna引物和探针，并委托某生物公司合成；

8、根据genbank中检索的多株猪圆环病毒4型参考序列使用primer premier5软件设计全长引物，进行pcr扩增，pcr体系为50μl，其中mix25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，dna模板2μl，灭菌水19μl；

9、(4)pcr产物回收及纯化

10、根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用,置于-20℃保存；

11、(5)标准质粒的构建

12、根据某公司的pmdtm19t vector cloning kit使用说明书，构建pmdtm19t-cap重组质粒；

13、(6)重组质粒鉴定

14、取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与cap基因全长进行比对分析；

15、(7)质粒dna小量抽提

16、根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pmdtm19t-cap重组质粒备用；

17、(8)crrna纯化

18、双链dna的合成：将上述合成的crrna单链退火成dna双链，反应体系为50μl，95℃退火5min，自然冷却至室温；

19、转录：将退火得到的双链进行转录，转录试剂购自南京某生物科技股份有限公司，转录体系如下，转录所需dna模板的用量应在0.1～1μg，轻轻混匀各组分，并短暂离心收集，37℃孵育2h，程序结束后，加入1μl的dnaseⅰ，37℃孵育15min，消化转录的dna模板；

20、crrna纯化；

21、(9)猪圆环病毒4型crispr-cas12a检测体系建立

22、反应时间的优化，反应时间分别设置为5min、10min、15min、20min、25min，30min，35min和40min对pcv4的最佳反应时间进行筛选，并用于后续试验；

23、对设计的三对猪圆环病毒4型crrna引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育30min,在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；

24、灵敏度试验；

25、特异性试验；

26、临床样本检测：根据dna提取方法进行对临床样本进行dna的提取，与era-基础型核酸扩增试剂相结合，使用primer premier 5软件，设计cap基因的era引物，采用本研究建立的crispr cas12a方法对15份样本进行pcv4的检测，同时，使用qpcr技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价crispr技术的临床应用的实用价值；

27、(10)实验结果

28、cap基因重组质粒构建；

29、猪圆环病毒4型的反应时间优化：反应时间分别设置为5min、10min、15min、20min、25min，30min，35min和40min对pcv4的最佳反应时间进行筛选，检测荧光强度，在30min以后趋于稳定，最终选择30min用于后续试验；

30、crrna引物筛选：使用crispr-dt引物设计软件设计猪圆环病毒4型cap基因的crrna引物3条以及一条荧光探针，对设计的三对引物进行筛选，经过筛选第2对引物最优，并用于后续试验；

31、猪圆环病毒4型的灵敏度实验；

32、猪圆环病毒4型的特异性实验；

33、猪圆环病毒4型的临床样本检测。

34、优选的，所述病毒dna的提取包括以下操作步骤：

35、s1、用移液器将20ul proteinase k加入一个干净的1.5ml离心管；

36、s2、向离心管中加入200ul血清；

37、s3、加入200ulcarrier rna工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；

38、s4、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；

39、s5、加入500ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀；

40、s6、在室温下15～25℃放置5min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；

41、s7、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至rnase-free吸附柱cr2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

42、s8、小心打开吸附柱盖子，加入500ul缓冲液gd，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

43、s9、小心打开吸附柱盖子，加入600ul漂洗液pw，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

44、s10、重复步骤9；

45、s11、小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；

46、s12、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全边干，弃废液；

47、s13、将吸附柱放入一个rnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150ul rnase-free ddh2o，盖上盖子，室温放置5min，12000rpm离心1min，置于-20℃保存。

48、优选的，所述crrna纯化的操作步骤如下：

49、s1、将转录产物rnase free ddh2o补足至100μl，rna用量不要超过100μg；

50、s2、加入300μl buffer rp，涡旋混匀10s，室温静置5min；

51、s3、加入250μl无水乙醇，涡旋混匀15s，若回收小分子rna,＜200nt，加入600μl无水乙醇；

52、s4、将hipure rna柱子套在收集管中，把上述混合液转移至柱子中，10000xg离心30-60s，当混合液＞700μl时，一次最多转移700μl至柱子中，多余的分次加入；

53、s5、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入500μl buffer rw2至柱子中，已用无水乙醇稀释，静置2min，10000xg离心30～60s；

54、s6、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入500μl buffer rw2至柱子中，已用无水乙醇稀释，10000xg离心30～60s；

55、s7、倒弃滤液，把柱子套回收集管中，13000xg离心2min；

56、s8、把柱子套在1.5μl离心管中，加入15-30μlrnase free water至柱子膜中央，放置1min，13000离心1min；

57、s9、若需获得最高产量，重复上一步进行第二次洗脱；

58、s10、弃去柱子，用超微量核酸蛋白分析仪检测纯化后引物浓度，并将rna保存于-20℃。

59、优选的，所述era引物详细试验方案如下：

60、s1、按照图9反应体系制备样本预混液，充分震荡混匀并短暂离心；

61、s2、对于每份样本，将48μl预混液转移至每管基础扩增试剂中，振荡混直到扩增试剂重悬，并短暂离心；

62、s3、对于每份样本，在反应管盖上加上2μl激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心；

63、s4、将反应管放入恒温仪37-40℃中孵育20分钟。

64、优选的，所述灵敏度试验操作步骤：

65、测量出质粒浓度，并根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02×1023×浓度(ng/μl)×10-9]/[dna长度×660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释cap基因重组质粒(pmd19-t-cap)，稀释浓度为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl、108copies/μl、109copies/μl并使用灭菌水作为实验的阴性对照。

66、优选的，所述特异性试验操作步骤如下：

67、使用pcv2、pcv3、pclv、prrsv、csfv、pedv为对照，阳性和阴性对照分别使用阳性样本和ddh2o，进行特异性试验，验证crispr方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。

68、优选的，所述基因重组质粒构建具体包括以下操作步骤：

69、所述基因重组质粒构建具体包括以下操作步骤：

70、pmdtm-19t-pcv4-cap基因重组质粒构建，提取待检测样本的核酸在pcr扩增之后，针对扩增的片段使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证，与预期相符的目的基因片段在蓝光切胶仪的辅助下切取目的条带，进行胶回收实验，并与pmdtm19-t载体连接，转化到dh5α中；

71、重组质粒鉴定测序，将构建的质粒送到南京某生物科技有限公司进行测序，测序结果在ncbi的blast网站、genbank基因库和meglign软件的辅助下进行序列比对，结果显示，测序结果与所需目的基因片段的对应率达到100％，表明目的基因重组质粒构建合格，无变异，可作为阳性对照使用。

72、优选的，所述猪圆环病毒4型的灵敏度实验操作步骤如下：

73、猪圆环病毒4型cap基因菌液在lb培养液中过夜培养，使用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒后，以10倍的稀释倍数对提取的重组质粒进行稀释，在紫外线灯下观察，crispr-cas12a技术荧光结果显示检测猪圆环病毒的灵敏度达到了9×100copies/μl。

74、优选的，所述猪圆环病毒4型的特异性实验操作步骤如下：

75、所述猪圆环病毒4型的特异性实验操作步骤如下：

76、使用pcv2、pcv3、pclv、prrsv、csfv和pedv为对照，pcv2、pcv3、pclv、pedv、prrsv为临床样本提取的核酸，csfv为疫苗株，阳性和阴性对照分别使用阳性样本和ddh2o，进行特异性试验，pcv2、pcv3、pclv、prrsv、csfv和pedv在紫外灯下不发光，阳性对照明显发绿光，阴性对照没有变化。

77、优选的，所述猪圆环病毒4型的临床样本检测操作步骤如下：

78、采用本研究建立的crispr cas12a方法对15份样本进行pcv4的检测，同时，使用qpcr技术检测方法平行检测，两者的检出率一致，crispr-cas12a技术具有临床应用价值。

79、(二)有益效果

80、本发明提供了一种基于crispr-cas12a检测猪圆环4型病毒的引物、探针及检测方法，具备以下有益效果：

81、本研究在crispr技术的基础上与era技术相结合，建立了pcv4的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要复杂的仪器设备、对于冷链运输和非专业人员，即使在偏远地区也能对疫病进行实时监测，为pcv4的流行病学的调查，掌握传播规律以及疫病的防控提供技术支持。