一种突变型重组月季多酚氧化酶原及其制备方法与应用

本发明属于生物，具体涉及一种突变型重组月季多酚氧化酶原及其制备方法与应用。

背景技术：

1、红茶是最受欢迎的饮品之一，红茶中茶黄素等活性物质赋予其令人愉悦的汤色、香气以及保健价值。茶黄素比茶多酚更稳定，具有更好抗氧化、降脂和抗癌等功效，而且是形成茶褐素必需的功能物质。然而，大多数红茶中茶黄素的含量不足2％，因此，开发茶黄素的高效制备技术受到广泛关注。

2、少数厂家采用有机溶剂提取、化学氧化或酶法转化等方法生产茶黄素产品，但是，产品中茶黄素含量较低(<53％)。在现有的制备方法中，直接提取成本高，化学氧化法不环保，酶法转化采用多酚氧化酶催化茶多酚转化成茶黄素，是生产茶黄素的发展方向。申请人团队前期工作表明，重组野生型月季源多酚氧化酶原激活后能催化茶多酚合成茶黄素，但是，其酶学性质还难以满足酶法转化制备茶黄素对酶制剂的要求。

3、从自然界直接挖掘得到的新酶的活性和稳定性往往较低，制约了酶法转化制备茶黄素的规模化应用。分子改造是提高多酚氧化酶酶学性质的有效手段，2022年，zhou等人通过定向进化改造巨大芽孢杆菌来源多酚氧化酶，提高了突变酶活性。然而，尚未见到通过半理性改造改善多酚氧化酶酶学性质的相关报道。

技术实现思路

1、为解决相关问题，本发明的第一目的在于提供一种突变型重组月季多酚氧化酶原；所述的突变型重组月季多酚氧化酶原的酶活和热稳定性均获得了显著的改善。

2、本发明的第二目的在于提供一种突变型重组月季多酚氧化酶原的制备方法，实现了所述的突变型重组月季多酚氧化酶原的高效可溶表达。

3、本发明的第三目的在于提供一种突变型重组月季多酚氧化酶原的激活方法，所述激活方法获得的突变型重组月季多酚氧化酶原激活产物活性强，催化效率高。

4、本发明的第四目的在于提供上述突变型重组月季多酚氧化酶原或其激活产物的应用。

5、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

6、一种突变型重组月季多酚氧化酶原，其氨基酸序列如seq id no:1所示。seq idno：1所示突变型重组月季多酚氧化酶原与野生型重组月季多酚氧化酶原的氨基酸序列seqid no：2相比，具有以下氨基酸突变：471位亮氨酸突变为苯丙氨酸；472位丙氨酸突变为赖氨酸；632位天冬酰胺突变为异亮氨酸；同时，所述的氨基酸序列的n末端和c末端融合了mbp标签和his标签，可以显著提高突变型重组月季多酚氧化酶原的可溶性及便于纯化。

7、编码上述突变型重组月季多酚氧化酶原的dna分子，其核苷酸序列如seq id no：3所示。所述的核苷酸序列基于大肠杆菌表达系统对密码子进行了优化，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

8、一种重组表达载体，含有编码所述的突变型重组月季多酚氧化酶原的核苷酸序列。

9、优选的，所述的重组表达载体含有如seq id no：3所示的核苷酸序列。

10、上述突变型重组月季多酚氧化酶原的制备方法，包括如下步骤：

11、将编码所述的突变型重组月季多酚氧化酶原的核苷酸序列克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转化原核表达系统中进行诱导表达，固液分离收集菌体沉淀，纯化后得到所述的突变型重组月季多酚氧化酶原。

12、所述的原核表达系统优选为大肠杆菌表达系统；更优选为大肠杆菌表达系统bl21(de3)。

13、所述的重组表达载体优选为通过tac启动子进行表达的表达载体；更优选为含有mbp和his标签的表达载体，最优选为pmal-c5x或pmal-c5x-his，可以极大地增加目的蛋白表达的可溶性。

14、所述的诱导表达的具体操作步骤优选为：将阳性转化体接种于含有50～100μg/ml氨苄青霉素的lb培养液进行培养。当菌液od600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.1～0.2mm的iptg，15～20℃诱导12～28h，纯化得到突变型重组月季多酚氧化酶原。

15、所述的接种阳性转化体于lb培养液中并培养的步骤优选为：

16、(1)将所述的阳性转化体在lb培养液中于25～40℃培养振荡过夜，得到种子液；

17、(2)将种子液接种到lb培养液中，于25～40℃，150～250r/min条件下培养。

18、步骤(2)中所述的接种的接种量优选按与lb培养液的体积比为1:50～1:150进行接种。

19、所述的纯化的步骤优选为：裂解细胞后收集上清液，将上清液过亲和层析柱，洗脱得到纯化后的突变型重组月季多酚氧化酶原。

20、所述的裂解细胞的步骤优选为：用超声破碎法在冰浴下裂解细胞；更优选将菌体于缓冲液a中进行重悬；所述的缓冲液a的配方为20～50mm tris-hcl、50～200mm nacl。

21、所述的缓冲液a的用量优选为每克菌体加入10ml缓冲液a。

22、所述的超声破碎法的条件优选为：功率为50～300w，超声1～5s，间隔1～5s，持续2～50min。

23、所述的收集上清液的步骤优选为：裂解后的菌体进行冷冻离心后弃沉淀，过膜，得到所述的上清液。

24、所述的冷冻离心的条件优选在4℃条件下12000r/min离心30～40min。

25、所述的过膜优选为用0.45μm微孔滤膜过滤。

26、所述的亲和层析柱优选为his标签亲和层析柱。

27、所述的洗脱优选为先用缓冲液a平衡，再用缓冲液b洗脱；所述的缓冲液a的配方为20～50mm tris-hcl、50～200mm nacl；所述的缓冲液b的配方为：20～50mm tris-hcl、50～200mm nacl、100～500mm咪唑，ph 8.0。

28、上述突变型重组月季多酚氧化酶的激活方法(即一种突变型重组月季多酚氧化酶的制备方法)，包括如下步骤：将上述突变型重组月季多酚氧化酶原经0.1～1mg/ml，优选10～100μg/ml，最优选40μg/ml胰蛋白酶处理激活后，固液分离去除沉淀，得到突变型重组月季多酚氧化酶激活产物。

29、所述的激活的条件优选为温度15～45℃、时间10～60min和ph3.0～8.0；更优选为温度25℃、时间15min和ph8.0。

30、所述的激活优选在在含有如下成分的缓冲液中进行：50±10mm tris-hcl、50±10mm nacl中进行。

31、一种突变型重组月季多酚氧化酶原激活产物(即一种突变型重组月季多酚氧化酶)，通过上述突变型重组月季多酚氧化酶原的激活方法得到。

32、上述突变型重组月季多酚氧化酶原激活产物在催化茶多酚转化为茶黄素中的应用(即上述突变型重组月季多酚氧化酶原激活产物在制备茶黄素中的应用)。

33、所述的茶多酚包括但不限于儿茶酚型儿茶素和邻苯三酚型儿茶素。

34、所述的儿茶酚型儿茶素包括ec和ecg，所述的邻苯三酚型儿茶素包括egc和egcg。

35、所述的茶黄素包括茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素-3，3’-双没食子酸酯。

36、所述的应用反应条件为温度10～50℃，ph3.0～7.0；更优选为温度30℃，ph5.0或5.5。

37、所述的应用在含有如下成分的缓冲液中进行：20～50mm na2hpo4-柠檬酸。

38、所述的应用中，所述的突变型重组月季多酚氧化酶原激活产物的用量按其在体系中的浓度为0.1～1mg/ml计，更优选按0.6mg/ml计。

39、所述的应用中，所述的茶多酚的用量按其在体系中的浓度为0.5～10mm计；更优选按1～3mm计。

40、所述的应用的通过沸水浴加热10～15min终止反应。

41、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

42、1、本发明采用原核表达和环保高效的胰蛋白酶激活方法，获得可溶且能被高效激活的突变型重组月季多酚氧化酶原，目的蛋白含量占总蛋白的60％以上，表达量较高，且在目的蛋白的n端和c端分别融合促溶的mbp标签和易于表达的his标签。它不但增加目的蛋白的表达量和可溶性，还简化酶原的分离纯化，易于大量表达。与天然提取的方法相比，本方法只需要简单的培养基作为原料，适合工业化生产。

43、2、本发明采用半理性改造的方法，获得突变型重组月季多酚氧化酶，显著地改善重组月季多酚氧化酶的活性和稳定性。

44、3、突变型重组月季多酚氧化酶在催化合成茶黄素的效率上优于野生型重组月季多酚氧化酶。其中，tf1在突变型重组月季多酚氧化酶催化下的产率明显增加，达到70.65％。