人源抗鼠疫耶尔森菌LcrV的抗体及其相关产品和用途的制作方法

本发明属于生物医学，涉及人源抗鼠疫耶尔森菌lcrv的抗体及其相关产品和用途。

背景技术：

1、鼠疫俗称黑死病，是由鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis，以下简称鼠疫菌)感染引起的一种自然疫源性烈性传染病。人感染鼠疫后可表现为腺鼠疫、肺鼠疫和败血症鼠疫等，其中肺鼠疫发病急，传染性强(可通过飞沫传播)，不及时治疗病死率可达100％。鼠疫在人类历史上共引起三次大流行，共导致了约1.6亿人丧生。

2、鼠疫菌属于耶尔森菌属(yersinia)，该属的典型形态是短而粗、两极浓染的小杆菌，有荚膜，无鞭毛和芽孢的革兰阴性菌。鼠疫菌的主要保护性抗原为f1抗原和低钙应答v抗原(low-calcium response v antigen，lcrv)，即v抗原。其中f1为细菌荚膜，是鼠疫的主要保护性抗原。抗f1抗体可协同干扰病原菌的类鞭状体结构(injectosome)头部的v抗原，同免疫细胞间的整合，从而对抗病菌的入侵。v抗原和其他分泌性耶氏菌外膜蛋白(yersinia outer protein，yop)yopb及yopd，由75kb lcr质粒编码，构成重要的iii型分泌系统(type iii secretion system，t3ss)，是鼠疫菌感染入侵的基本毒力因子和诱导机体产生保护性应答的重要抗原，抗v抗体可阻止效应蛋白yop的递送。v抗原一直是鼠疫研究的热点，同样作为保护性抗原，v抗原和f1抗原具有协同保护效应，目前在研的鼠疫重组亚单位疫苗也都是采用f1+v的组合。同时针对v抗原的单克隆抗体也具有与f1抗体协同保护效果，甚至非保护性的v抗体也能明显提高f1抗体的保护效果。

3、因此，本研究拟采用基因工程手段，拟从鼠疫疫苗临床试验受试者外周血中获得针对鼠疫v抗原的全人源单克隆抗体，初步评价鼠疫抗体与抗原结合特异性参数等，进而深入了解鼠疫的致病机制，为研究人体针对鼠疫抗原免疫应答奠定基础，为制备针对鼠疫的诊断及治疗提供候选分子。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供人源抗鼠疫耶尔森菌lcrv的抗体及其相关产品和用途。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明的第一方面提供了一种抗鼠疫耶尔森菌lcrv的单克隆抗体。

4、进一步，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含hcdr1-3，所述轻链可变区包含lcdr1-3；

5、所述hcdr1-3为如seq id no:7所示的重链可变区中的hcdr1-3；

6、所述lcdr1-3为如seq id no:8所示的轻链可变区中的lcdr1-3。

7、进一步，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示或分别与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3具有至少70％同源性；

8、所述lcdr1、lcdr2、lcdr3的氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5、seq idno:6所示或分别与seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6具有至少70％同源性。

9、在某些实施方案中，与所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3具有至少70％同源性的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的抗体同样包含在本发明的保护范围内，其中，至少70％同源性包括至少70％同源性、至少75％同源性、至少80％同源性、至少85％同源性、至少86％同源性、至少87％同源性、至少88％同源性、至少89％同源性、至少90％同源性、至少91％同源性、至少92％同源性、至少93％同源性、至少94％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或者至少99％同源性。

10、在本发明中，所述同源性是指一定程度的互补性。可以是部分同源、基本同源或完全同源。基本同源是指至少部分抑制相同序列与靶核酸杂交的部分互补序列。可在低严谨性条件下使用杂交实验(southern或northern印迹，溶液杂交等)检验对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本同源的序列或杂交探针在低严谨性条件下将竞争并抑制完全同源序列与靶序列的结合。这并不是说低严谨性条件允许非特异性结合；低严谨性条件需要两条序列的相互结合是特异性(选择性)相互作用。

11、在某些实施方案中，本发明所述hcdr1、hcdr2、hcdr3对应的氨基酸序列并不局限于如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示的氨基酸序列，本发明所述lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的氨基酸序列也并不局限于如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6所示的氨基酸序列，采用任何cdr编号方案(现有的cdr编号方案或将来产生的新的cdr编号方案)分别对如seq id no:7所示的重链可变区中的cdr1、cdr2、cdr3进行定义、对如seq idno:8所示的轻链可变区中的cdr1、cdr2、cdr3进行定义得到的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

12、在具体实施方案中，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3是根据imgt编号方案、chothia编号方案、kabat编号方案、martin(增强型chothia)编号方案、abm编号方案、aho编号方案、contact编号方案中的任意一种定义或任意多种(两种或两种以上)组合定义得到的，经上述定义方式定义得到的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的抗体的序列同样包含在本发明的保护范围内。

13、本发明的第二方面提供了一种双特异性抗体。

14、进一步，所述双特异性抗体包含本发明第一方面所述的单克隆抗体；

15、优选地，所述双特异性抗体还包含一个与其它抗原特异性结合的第二抗体；更优选地，所述第二抗体特异性结合鼠疫耶尔森菌f1抗原。

16、在某些实施方案中，本发明所述的第二抗体并不局限于特异性结合鼠疫耶尔森菌f1抗原，能够特异性结合目前本领域已知的任何抗原的第二抗原均可与本发明第一方面提供的单克隆抗体结合形成双特异性抗体，基于此得到的双特异性抗体均包含在本发明的保护范围内。

17、本发明的第三方面提供了一种分离的多核苷酸。

18、进一步，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

19、优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seq id no:9所示；

20、优选地，编码本发明第一方面所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seq id no:10所示。

21、在本发明中，所述多核苷酸一般是指任何核酸序列，例如，任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，它可以是未修饰的rna或dna，或者修饰的rna或dna。包括但不限于：单链和双链dna，包括单链和双链区的dna，单链和双链rna以及包括单链和双链区的rna，包含dna和rna的杂交分子(可为单链或(更典型的)双链或包含单链和双链区)。也包括含有rna或dna或者rna和dna的三链区。具体而言，包括mrna、cdna和基因组dna及其任何片段。所述多核苷酸包括含有一个或多个修饰碱基如含氚碱基或非常见碱基如肌苷的dna和rna。本发明所述的多核苷酸可涵盖编码或非编码序列，或正义或反义序列或irna如sirna。应当理解的是本文中每一处提及的多核苷酸或类似术语将包括全长序列，及其任何互补序列、片段、变化形式、衍生物或变体。

22、本发明的第四方面提供了一种表达载体。

23、进一步，所述表达载体包含本发明第三方面所述的多核苷酸；

24、优选地，所述载体包括质粒、病毒来源的载体、噬菌粒、粘粒、人工染色体；

25、更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体。

26、在本发明中，对表达本发明所述单克隆抗体或双特异性抗体的编码序列的载体并无特别限制，包括但不限于：微生物体如重组噬菌体、质粒或粘粒dna表达载体转化的细菌；酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(如杆状病毒)转化的昆虫细胞系统；病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒camv、烟草花叶病毒tmv)或细菌表达载体(如ti、pbr322质粒)转化的植物细胞；或动物细胞系统。对于细菌，有用的质粒包括invitrogen公司的pet、prset、ptrchis2和pbad质粒；novagen公司的pet和pcdf质粒以及sigma-aldrich公司的directortm质粒。对于产甲烷菌，有用的质粒包括但不限于pme2001、pmv15和pmp1。

27、控制元件和调节序列是载体的非翻译区-增强子、启动子、5′和3′非翻译区--它们与宿主细胞蛋白质相互作用，进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能不同。根据所使用载体系统和宿主类型，可使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当克隆进细菌系统时，可使用诱导型启动子，如bluescript噬菌粒或psport1质粒的杂交lacz启动子等。可在昆虫细胞中使用杆状病毒多角体蛋白启动子。可将来源于植物细胞基因组(如热休克、rubisco和存储蛋白质基因)的启动子或增强子或来自于植物病毒的启动子或增强子(如病毒启动子或前导序列)克隆到载体中。

28、本发明的第五方面提供了一种宿主细胞。

29、进一步，所述宿主细胞包含本发明第三方面所述的多核苷酸或本发明第四方面所述的表达载体；

30、优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；

31、更优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；

32、更优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、链球菌、放线菌；

33、最优选地，所述哺乳动物细胞包括ns0细胞、cho细胞、cos细胞、hek293细胞、vero细胞、卵母细胞。

34、在本发明中，对所述宿主细胞的类型并无特别限制，任何适当的宿主细胞均可用于编码本发明所述单克隆抗体的dna序列或本发明所述核酸分子的表达，包括但不限于：哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。在一些实施方案中，优选为哺乳动物细胞为宿主细胞。

35、本发明的第六方面提供了一种检测试剂或检测产品。

36、进一步，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

37、优选地，所述检测试剂还包含与本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体偶联或缀合的诊断剂；

38、更优选地，所述诊断剂包括生物发光剂、化学发光剂、顺磁性离子、放射性核素、酶、光敏诊断剂；

39、优选地，所述检测产品包含所述检测试剂；

40、更优选地，所述检测产品包括检测试剂盒、检测试纸条、检测芯片。

41、在本发明中，所述诊断剂并不局限于生物发光剂、化学发光剂、顺磁性离子、放射性核素、酶、光敏诊断剂，任何能够与本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体偶联或缀合以用于鼠疫耶尔森菌检测或鼠疫耶尔森菌感染性疾病诊断的试剂均在本发明的保护范围内。

42、本发明的第七方面提供了一种药物组合物或药物制剂。

43、进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体和/或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

44、优选地，所述药物制剂包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体和/或所述药物组合物。

45、在某些实施方案中，本发明提供的药物组合物或药物制剂可通过任何本领域已知的途径对有需要的受试者进行施用，包括但不限于：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠方式。

46、在某些实施方案中，本发明提供的药物制剂的剂型包括但不限于：注射剂、片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、凝胶剂、糖浆、浆液或混悬剂。

47、在某些实施方案中，本发明提供的药物组合物或药物制剂中还可包含药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂包括但不限于：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇；淀粉；甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠；阿拉伯胶、黄芪胶；明胶、胶原；交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐，如藻酸钠；滑石粉、硬脂酸镁；脂肪油；聚乙二醇；卡波姆凝胶；二氧化钛；可食用染料；右旋糖苷。

48、本发明的第八方面提供了如下任一种方法：

49、(1)一种生产本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤：在适合抗体产生的条件下，培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从宿主细胞培养产物中分离得到本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体；

50、(2)一种制备本发明第五方面所述的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的双特异性抗体引入到宿主细胞中，得到本发明第五方面所述的宿主细胞；

51、(3)一种非诊断目的地检测待测样品中鼠疫耶尔森菌lcrv蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第六方面中所述的检测试剂与待测样品接触，检测lcrv蛋白与所述抗体免疫复合物的形成。

52、本发明的第九方面提供了如下任一种应用：

53、(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌lcrv蛋白的检测试剂中的应用；

54、(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌lcrv蛋白的检测产品中的应用；

55、(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面所述的检测试剂或检测产品在制备用于诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的产品中的应用；

56、(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面所述的检测试剂或检测产品在非诊断目的地检测鼠疫耶尔森菌lcrv蛋白中的应用；

57、(5)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染性疾病的药物组合物或药物制剂中的应用。

58、此外，本发明还提供了一种诊断和/或辅助诊断鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。

59、进一步，所述方法包括如下步骤：采用本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第三方面所述的多核苷酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面所述的检测试剂或检测产品对受试者来源的待测样品进行检测，通过抗原抗体反应来检测待测样品中鼠疫耶尔森菌lcrv蛋白的存在情况，以诊断和/或辅助诊断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染性疾病。

60、在某些实施方案中，本发明对待测样品并无特别限制，所述待测样本来源于有需要的受试者的临床样本，包括但不限于：细胞、组织、体液，例如：皮肤；黏膜；血液；血液衍生物，例如血清；提取的胆汁；活组织检查或手术取出的组织，包括例如未固定的、冷冻的、固定在福尔马林和/或包埋在石蜡中的组织；泪液；乳汁；皮屑；表面清洗液；尿液；痰液；脑脊液；前列腺液；脓；骨髓吸出物；中耳流出物；支气管肺泡灌洗物；痰液或唾液。在另一些实施方案中，所述待测样品还可以是环境样品或食品样品。

61、此外，本发明还提供了一种治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染性疾病的方法。

62、进一步，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的双特异性抗体、本发明第七方面所述的药物组合物或药物制剂。

63、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

64、本发明提供了一种全新的针对鼠疫耶尔森菌lcrv抗原的全人源单克隆抗体rv-b4，经实验验证发现，所述单克隆抗体rv-b4能够特异性结合鼠疫耶尔森菌lcrv，且具有非常高的特异性和亲和力，可有效用于检测鼠疫耶尔森菌，在鼠疫耶尔森菌相关的检测试剂或检测产品开发中具有重要的应用价值。