用于检测B族链球菌的核酸检测组合物、检测装置及方法与流程

本发明涉及核酸分子检测领域，特别涉及一种用于检测b族链球菌的核酸检测组合物、检测装置及方法。

背景技术：

1、b族链球菌(group bstreptococcus，简称gbs)是一种定植于人类生殖道和胃肠道、部分定植于儿童和成人上呼吸道的革兰阳性球菌，威胁孕产妇及新生儿健康。gbs感染是早期新生儿感染的主要危险因素，gbs阳性孕妇中约50％会垂直传播给新生儿，1％～2％发展成新生儿早发型gbs感染，通常会导致其败血症、肺炎和脑膜炎，并严重威胁其生命，死亡率高达5％。因此，在分娩前，需对妊娠晚期孕妇行b族链球菌筛查，并根据筛查结果给孕妇提供针对性的防治措施，从而最大限度地降低胎膜早破、早产及围产儿死亡的发生率，进而使母婴受生殖道感染的危害降至最低，改善母婴生存质量。

2、分子即时诊断技术(分子poct)作为一种高灵敏度体外诊断方法，到现在已经有十几年的历史。伴随着核酸恒温扩增、分子信息学、微流控技术、远程通讯等多个技术领域的不断进步，采用分子poct技术可以快速检测并得到结果，在院外由普通人操作也能实现高性能的核酸检测。可适用于家庭检测、团体检测、院内检测等多个场景。

3、核酸直扩技术作为一种简化的核酸扩增方法，可以在省去核酸提取和纯化步骤的情况下，直接使用粗样本进行扩增。快速恒温扩增指温度恒定，在30min以内可以判断结果的扩增方式，其简单性与核酸直扩技术相适应，二者结合不仅无需进行繁琐的样品处理步骤，大大节约时间成本，同时可以极大的缩小检测装置的结构，无需复杂的提取过程和控制结构。专利cn107164493a，提供了一种gbs核酸检测试剂盒可以用于完成整个gbs核酸检测的工序，不仅可以脱离gbs核酸检测对于大量设备的依赖，提升检测效率，而且可以避免在检测过程中引入污染，提升检测精度。但其存在便利性不高、方法较复杂、成本较高等不足。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于检测b族链球菌的核酸检测组合物、检测装置及方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种用于检测b族链球菌的核酸检测组合物，包括用于恒温扩增gbs的camp基因上的靶标基因的上游引物、下游引物，以及用于检测靶标基因的探针，所述上游引物的序列如seq id no.1所示，所述下游引物的序列如seq id no.2所示；

3、优选的是，上、下游引物各0.1-0.5μm，探针0.05-0.25μm。

4、所述探针的序列中，距离探针5’端的30-35nt的中部位置标记一个thf，作为核酸外切酶的识别位点，在探针5’端标记有一个荧光素fam，在探针的3’末端标记有一个c3spacer。

5、优选的是，所述探针的序列如seq id no.3所示。

6、优选的是，所述靶标基因的序列如seq id no.4所示。

7、优选的是，所述的用于检测b族链球菌的核酸检测组合物还包括用于进行恒温扩增的扩增反应辅助试剂，所述扩增反应辅助试剂包括200-400ng/μl重组酶、200-400ng/μl重组酶辅因子、500-1000ng/μl单链dna结合蛋白、100-200ng/μldna聚合酶、200-300ng/μl肌酸激酶。

8、优选的是，所述的用于检测b族链球菌的核酸检测组合物还包括用于稀释核酸扩增产物的稀释缓冲液，所述稀释缓冲液包括50-150mm tris-hcl和10-100mm edta。稀释缓冲液体积为200-300μl。

9、优选的是，所述的用于检测b族链球菌的核酸检测组合物还包括用于裂解样本的裂解液，所述裂解液包括50-100mm tris-hcl、50-80mm edta、2wt％-5wt％吐温、0.5-2mm盐酸胍、0.5-2mm异硫氰酸胍、0.5-1m nacl、2wt％-5wt％十二烷基硫酸钠、2-5wt％十二烷基肌氨酸钠和去离子水。裂解液体积100-150μl。

10、优选的是，所述的用于检测b族链球菌的核酸检测组合物还包括用于辅助进行恒温扩增的溶解液，所述溶解液包括30-50mm tris-hcl、50-100mm醋酸钾、50-100mm醋酸镁、50-100mm磷酸肌酸、1-5mm三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、100-500μm dntps、1-5mm atp、8％-10％w/v聚乙二醇10000和1-5％w/v聚乙烯吡咯烷酮。溶解液体积100-200μl。

11、本发明的第二方面，提供一种用于检测gbs的核酸检测装置，其采用如上所述的组合物通过恒温扩增实现gbs的检测，该检测装置包括由上至下依次契合设置的顶盖、功能层和底座；

12、所述顶盖上设置有按压结构、观察窗、加样口以及与加样口配合的密封盖；

13、所述功能层上设置有依次连通的储液仓、加样仓、扩增仓、缓冲仓以及检测仓，所述功能层的底部设置有导热片，所述扩增反应辅助试剂被制成冻干试剂储存在所述扩增仓内；

14、所述底座上设置有柔性加热膜和加热和温控电路板，所述柔性加热膜位于所述导热片的正下方。

15、优选的是，扩增仓内部体积为50-150μl，更优选为50μl。

16、优选的是，所述顶盖连接在功能层上后，所述加样口通过导流槽连通至所述加样仓，所述扩增仓的上方通过溢流通道与所述缓冲仓连通；

17、所述检测仓内设置有核酸试纸条，所述观察窗位于所述核酸试纸条的上方。

18、优选的是，所述按压结构包括上端具有上限位边沿的按压柱、套设在所述按压柱上且处于所述上限位边沿和功能层之间的弹簧以及设置在所述按压柱底部且伸入所述储液仓内的下限位边沿；

19、所述储液仓内设置有位于按压结构的下限位边沿的正下方的储液囊泡，所述储液囊泡内存储有所述稀释缓冲液，所述储液囊泡能够在按压结构的挤压下破裂而使得内部存储的稀释缓冲液流出，并依次流经加样仓、扩增仓、缓冲仓和检测仓。

20、本发明的第三方面，提供一种用于检测gbs的核酸检测方法，其采用如上所述的装置通过恒温扩增实现gbs的检测，该方法包括以下步骤：

21、s1、将采样后的拭子插入到裂解液中进行待测样本的洗脱和裂解；

22、s2、将步骤s1所得裂解混合物滴加到所述加样口内，然后将溶解液滴入所述加样口内，通过密封盖密封所述加样口；

23、s3、连通电源，通过所述柔性加热膜对扩增仓恒温加热10-30min，加热温度控制为37-42℃；

24、s4、对按压结构的按压柱施加向下的挤压力，使所述储液囊泡破裂而释放其中的稀释缓冲液，在稀释缓冲液的流动下，所述扩增仓内的扩增产物被转移至所述检测仓内的核酸试纸条上；

25、s5、5-10min后通过检测窗口观察核酸试纸条上的t线和c线，t线和c线均显色为gbs阳性，t线不显色且c线显色为gbs阴性。

26、优选的是，快速恒温扩增方式可为mira、rpa、raa、era等，更优选为mira。

27、本发明的有益效果是：

28、本发明采用了多酶快速恒温扩增技术和免疫层析试纸条结合的方法，针对b族链球菌特异基因序列设计引物探针，并在引物探针上进行修饰，使扩增产物在流道试纸条t线上时可以被捕获并在t线处显色；整个过程只需要手动加样和按压按钮，操作简单且结果可视化，不依赖检测设备、环境和人员，可轻松检测和读取结果；

29、本发明的gbs核酸检测装置可以独立完成整个gbs检测工序，无需额外的设备以及复杂的人工干预，且避免了操作过程形成的二次污染，整体检测时间短，检测结果易于判读，操作方式简单，装置便携，适用于gbs的居家自检；其本发明的gbs核酸检测方法具有高效性、高特异性和高灵敏度，检测准确率较高；

30、本发明的检测装置中通过裂解液将样本粗裂解后与溶解液混合，混合后加入到加样口中，经导流槽作用，样本溶液被引流至扩增仓，多余的样本进入到缓冲仓；样本在扩增仓通过底部的控温芯片、柔性加热膜和导热片可实现均匀的恒温扩增，完成扩增后，通过按压储液仓顶部的按压结构压破储液囊，使预存的稀释缓冲溶液被挤压释放后流入到扩增仓，之后扩增产物被稀释并在填满填满缓冲仓后，最终稀释后的扩增产物会经流道导流到核酸试纸条上进行侧向层析，通过观测窗观测c/t线即可获取检测结果。