一种构建新型冠状病毒感染模型的方法及其应用

本发明属于生物技术，涉及一种构建新型冠状病毒感染模型的方法及其应用。

背景技术：

1、新型β冠状病毒-新型冠状病毒(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，sars-cov-2)主要感染呼吸系统，轻型患者仅表现为低热、轻微乏力；重症者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ards)和急性致死性肺衰竭甚至引发多脏器功能衰竭。sars-cov-2感染所引起的“细胞因子风暴”是脏器受损和导致重症或死亡的重要因素。因此，开发有效的抗冠状病毒药物，对于预防和治疗新型冠状病毒感染具有重要意义。

2、动物模型对于研究疾病的发生发展具有重要意义，并且有助于加快药物和疫苗的研发，目前，已经开发多个新型冠状病毒感染动物模型，如非人灵长类动物、k18-hace2转基因小鼠(k18 transgenic mice expressing human angiotensin-converting enzyme 2)、aav-hace2/ad5-hace2(表达hace2的腺相关载体或腺病毒5)转导致敏小鼠，以及叙利亚仓鼠、雪貂、家禽和家养动物等模型。开发sars-cov-2易感动物模型主要存在两方面障碍。首先，sars-cov-2病毒通过其包膜上携带的s蛋白特异性识别人体细胞ace2(angiotensin-converting enzyme2)受体蛋白进入细胞，但人ace2蛋白与鼠ace2存在较大的差异。所以目前能够作为新型冠状病毒感染动物模型的物种为k18-hace2转基因小鼠，aav-或ad5转导小鼠或非人灵长类动物，但价格昂贵、饲养成本高且不易得到；另一方面，sars-cov-2感染限于在3级动物生物安全实验室(absl-3)，导致成本和空间可用性严重受限。

3、综上所述，现有的新型冠状病毒感染动物模型构建方法存在如下问题：(1)sars-cov-2为生物安全等级三级的病原生物，安全性要求高，操作受限；(2)现有动物模型建模复杂，价格昂贵，转基因小鼠或ad5-hace2或aav-hace2转导小鼠筛选周期长、繁育周期长、随机整合容易表型不稳定、表型的组织特异性不明显，hace2异位可能会出现其他系统的感染，而非人灵长类动物模型、叙利亚仓鼠模型、水貂或雪貂模型价格昂贵，饲养成本高，操作困难；(3)实验周期长，传统新冠病毒感染需要4-5天才能监测到肺部病毒载量变化，肺指数的变化、体重的变化，以这些指标作为评判标准；(4)传统的肺部病毒载量测定需要空斑试验或tcid50测定，需要3-5天的时间，试验周期长，反应不灵敏，操作繁琐。因此，开发一种安全性更好、操作更简便且重现性更稳定的新型冠状病毒感染动物模型构建方法具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种构建新型冠状病毒感染模型的方法及其应用，以期开发一种安全性更好、操作更简便且重现性更稳定的新型冠状病毒感染动物模型构建方法。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种构建新型冠状病毒感染模型的方法，所述方法包括：

4、利用sars-cov-2复制子病毒感染实验动物，即得；

5、所述sars-cov-2复制子病毒包括以下元件：cmv真核启动子、编码序列、丁型肝炎病毒(hdv)核酶编码序列、牛生长激素(bgh)末端序列和和多聚腺苷化序列终止信号；

6、所述编码序列为以sars-cov-2 wuhan-hu-1的基因组序列(genbank id：mn908947.3)为基础，去除其中病毒棘突蛋白s的编码序列并替换为萤火虫荧光素酶编码序列。

7、本发明中，以病毒反向遗传学系统为基础构建sars-cov-2复制子病毒，删除刺突蛋白(spike,s)基因，用报告基因萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)替代，复制子的核心是在细胞内能够进行自我复制的核酸，与病毒感染性cdna克隆相比，复制子缺少病毒的结构蛋白元件，不能产生感染性的病毒颗粒，因此，可作为安全的工具应用于抗病毒药物、病毒复制过程的研究及复制相关宿主因子的筛选；荧光素酶报告基因是指以荧光(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)；本发明利用稳定携带firefly荧光素酶基因的重组复制子病毒为基础建立新冠病毒感染小鼠成像模型的方法，操作要求更低、安全性更好、操作更简便且重现性更稳定，为新冠病毒抗病毒药物的研发、评价等应用研究提供有效的技术平台。

8、优选地，所述sars-cov-2复制子病毒的基因组的核酸序列包括seq id no.1所示的序列。

9、seq id no.1：

10、attaaaggtttataccttcccaggtaacaaaccaaccaactttcgatctcttgtagatctgttctctaaacgaactttaaaatctgtgtggctgtcactcggctgcatgcttagtgcactcacgcagtataattaataactaattactgtcgttgacaggacacgagtaactcgtctatcttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaacacacgtccaactcagtttgcctgttttacaggttcgcgacgtgctcgtacgtggctttggagactccgtggaggaggtcttatcagaggcacgtcaacatcttaaagatggcacttgtggcttagtagaagttgaaaaaggcgttttgcctcaacttgaacagccctatgtgttcatcaaacgttcggatgctcgaactgcacctcatggtcatgttatggttgagctggtagcagaactcgaaggcattcagtacggtcgtagtggtgagacacttggtgtccttgtccctcatgtgggcgaaataccagtggcttaccgcaaggttcttcttcgtaagaacggtaataaaggagctggtggccatagttacggggccgatctaaagtcatttgacttaggcgacgagcttggcactgatccttatgaagattttcaagaaaactggaacactaaacatagcagtggtgttacccgtgaactcatgcgtgagcttaacggaggggcatacactcgctatgtcgataacaacttctgtggccctgatggctaccctcttgagtgcattaaagaccttctagcacgtgctggtaaagcttcatgcactttgtccgaacaactggactttattgacactaagaggggtgtatactgctgccgtgaacatgagcatgaaattgcttggtacacggaacgttctgaaaagagctatgaattgcagacaccttttgaaattaaattggcaaagaaatttgacaccttcaatggggaatgtccaaattttgtatttcccttaaattccataatcaagactattcaaccaagggttgaaaagaaaaagcttgatggctttatgggtagaattcgatctgtctatccagttgcgtcaccaaatgaatgcaaccaaatgtgcctttcaactctcatgaagtgtgatcattgtggtgaaacttcatggcagacgggcgattttgttaaagccacttgcgaattttgtggcactgagaatttgactaaagaaggtgccactacttgtggttacttaccccaaaatgctgttgttaaaatttattgtccagcatgtcacaattcagaagtaggacctgagcatagtcttgccgaataccataatgaatctggcttgaaaaccattcttcgtaagggtggtcgcactattgcctttggaggctgtgtgttctcttatgttggttgccataacaagtgtgcctattgggttccacgtgccagcgctaacataggttgtaaccatacaggtgttgttggagaaggttccgaaggtcttaatgacaaccttcttgaaatactccaaaaagagaaagtcaacatcaatattgttggtgactttaaacttaatgaagagatcgccattattttggcatctttttctgcttccacaagtgcttttgtggaaactgtgaaaggtttggattataaagcattcaaacaaattgttgaatcctgtggtaattttaaagttacaaaaggaaaagctaaaaaaggtgcctggaatattggtgaacagaaatcaatactgagtcctctttatgcatttgcatcagaggctgctcgtgttgtacgatcaattttctcccgcactcttgaaactgctcaaaattctgtgcgtgttttacagaaggccgctataacaatactagatggaatttcacagtattcactgagactcattgatgctatgatgttcacatctgatttggctactaacaatctagttgtaatggcctacattacaggtggtgttgttcagttgacttcgcagtggctaactaacatctttggcactgtttatgaaaaactcaaacccgtccttgattggcttgaagagaagtttaaggaaggtgtagagtttcttagagacggttgggaaattgttaaatttatctcaacctgtgcttgtgaaattgtcggtggacaaattgtcacctgtgcaaaggaaattaaggagagtgttcagacattctttaagcttgtaaataaatttttggctttgtgtgctgactctatcattattggtggagctaaacttaaagccttgaatttaggtgaaacatttgtcacgcactcaaagggattgtacagaaagtgtgttaaatccagagaagaaactggcctactcatgcctctaaaagccccaaaagaaattatcttcttagagggagaaacacttcccacagaagtgttaacagaggaagttgtcttgaaaactggtgatttacaaccattagaacaacctactagtgaagctgttgaagctccattggttggtacaccagtttgtattaacgggcttatgttgctcgaaatcaaagacacagaaaagtactgtgcccttgcacctaatatgatggtaacaaacaataccttcacactcaaaggcggtgcaccaacaaaggttacttttggtgatgacactgtgatagaagtgcaaggttacaagagtgtgaatatcacttttgaacttgatgaaaggattgataaagtacttaatgagaagtgctctgcctatacagttgaactcggtacagaagtaaatgagttcgcctgtgttgtggcagatgctgtcataaaaactttgcaaccagtatctgaattacttacaccactgggcattgatttagatgagtggagtatggctacatactacttatttgatgagtctggtgagtttaaattggcttcacatatgtattgttctttctaccctccagatgaggatgaagaagaaggtgattgtgaagaagaagagtttgagccatcaactcaatatgagtatggtactgaagatgattaccaaggtaaacctttggaatttggtgccacttctgctgctcttcaacctgaagaagagcaagaagaagattggttagatgatgatagtcaacaaactgttggtcaacaagacggcagtgaggacaatcagacaactactattcaaacaattgttgaggttcaacctcaattagag

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251、cagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtat

252、ttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatac

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259、gtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaa

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261、tgactcttcttcctgctgcagatttggatgatttctccaaacaattgcaacaatccatgagcagtgctgactcaactcaggcctaaactcatgcaga

262、ccacacaaggcagatgggctatataaacgttttcgcttttccgtttacgatatatagtctactcttgtgcagaatgaattctcgtaactacatagcaca

263、agtagatgtagttaactttaatctcacatagcaatctttaatcagtgtgtaacattagggaggacttgaaagagccaccacattttcaccgaggcca

264、cgcggagtacgatcgagtgtacagtgaacaatgctagggagagctgcctatatggaagagccctaatgtgtaaaattaattttagtagtgctatccccatgtgattttaatagcttcttaggagaatgacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

265、优选地，所述sars-cov-2复制子病毒的外壳包括vsv-g蛋白。

266、优选地，所述sars-cov-2复制子病毒的制备的方法包括：

267、将所述sars-cov-2复制子病毒的基因组插入的初始表达载体，得到病毒表达载体；将所述病毒表达载体与病毒包装载体转染至宿主细胞，进行培养并收集病毒。

268、优选地，所述初始表达载体包括质粒载体。

269、优选地，所述质粒载体包括pbac质粒载体。

270、优选地，所述病毒包装载体包括vsv-g质粒。

271、优选地，所述宿主细胞包括293t细胞。

272、优选地，所述sars-cov-2复制子病毒的感染浓度为2×109～2×1011拷贝数/μl。

273、优选地，所述实验动物包括小鼠、仓鼠、雪貂和猴等中任意一种。

274、优选地，所述小鼠包括balb/c小鼠。

275、本发明中，能够以balb/c小鼠做实验动物对象，相比较传统的转基因小鼠，非灵长类动物或水貂或雪貂等实验动物，节约成本，周期短，操作方便。

276、作为优选的技术方案，所述构建新型冠状病毒感染模型的方法包括：

277、将所述sars-cov-2复制子病毒的基因组插入到pbac质粒，得到病毒表达载体；将所述病毒表达载体与vsv-g质粒转染至293t细胞，进行培养并收集病毒，得到sars-cov-2复制子病毒；利用2×109～2×1011拷贝数/μl的sars-cov-2复制子病毒感染实验动物，即得。

278、第二方面，本明提供第一方面所述的构建新型冠状病毒感染模型的方法在评价或筛选抗新型冠状病毒感染的药物中的应用。

279、第三方面，本发明提供一种评价抗新型冠状病毒感染的药物的方法，所述方法包括：

280、利用第一方面所述的构建新型冠状病毒感染模型的方法构建模型，对模型施用待评价药物，将模型置于小动物成像系统中，测定荧光素酶表达水平，并以萤火虫荧光素酶信号值的降低作为评价药物治疗效果的指标。

281、第四方面，本发明提供一种筛选抗新型冠状病毒感染的药物的方法，所述方法包括：

282、利用第一方面所述的构建新型冠状病毒感染模型的方法构建模型，对模型施用候选药物，将模型置于小动物成像系统中，筛选使模型的肺组织中萤火虫荧光素酶信号值降低的候选药物。

283、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

284、(1)安全性高，可操作空间大，sars-cov-2复制子病毒单轮感染，不具有传染性，能在二级实验室操作，方便安全；

285、(2)建模速度快，本发明使用balb/c小鼠等作为实验动物对象，相比较传统的转基因小鼠，非灵长类动物或水貂或雪貂等实验动物，节约成本，周期短，操作方便；

286、(3)减少实验时间，本发明的造模小鼠直接滴鼻感染病毒，且肺部荧光素酶表达在感染后第二天即能够灵敏的被检测到；

287、(4)检测方法简单，本发明构建的感染模型能通过ivis(小动物成像系统)检测小鼠肺部生物发光强度，可视化小鼠肺部感染情况，为进一步病理研究、药物和疫苗的研制等提供了更方便快捷且安全的模型选择。