一种大肠杆菌K-12MG1655BLBYZT6及其应用的制作方法

本发明涉及母乳低聚糖生产，具体涉及一种大肠杆菌k-12 mg1655blbyzt6及其应用。

背景技术：

1、2’-岩藻糖基乳糖（2'-fl）是由d-葡萄糖、d-半乳糖和l-岩藻糖构成，是人乳寡糖中含量最丰富的低聚糖，在人乳中浓度约为2-5g/l，约占已检出的人乳总寡糖的30%。人乳寡糖是婴儿发育不可或缺的成分，有助于婴儿肠道中双歧杆菌属、乳杆菌属和拟杆菌属等益生菌的生长，有助于预防病原菌感染，调节免疫系统，促进婴儿大脑早期发育等功能。

2、2’-fl已在国外婴幼儿配方奶粉、乳制品和特殊用途食品中广泛使用。目前，国内外对2’-fl的研究主要集中在微生物发酵法生产2’-fl的菌株构建上，如：

3、cn114774343a公开了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用，通过crispr/cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中与底物降解以及中间产物分流相关的一系列基因，将不同的酶分别进行基因组过表达或者质粒过表达的调控，最终构建的大肠杆菌工程菌株3l发酵罐条件下2’-岩藻糖基乳糖发酵产率57.7g/l。

4、cn114032261a公开了一种降解发酵液中乳糖获得高纯度岩藻糖基乳糖的方法，累计通过了三次膜处理，以去除菌体和杂糖，膜过滤过程加入了重量4-6倍的水稀释料液；处理过程为降低乳糖含量，加入乳糖酶降解乳糖；离子交换脱盐处理截留浓液电导＜400us/cm，最终制备2’-岩藻糖基乳糖纯度不低于95%。

5、cn105814070a公开了使用模拟移动床色谱纯化中性人乳寡糖的方法，模拟移动床色谱柱对含人乳寡糖的发酵提取液进行一次或多次色谱分离，然后喷雾干燥后得到纯度92%以上的2’-岩藻糖基乳糖。

6、cn202110115032.6公开了一种2’-岩藻糖基乳糖的富集纯化方法，提纯步骤为过滤发酵液、低温加压浓缩发酵液、无水乙醇沉淀离心除蛋白、低温低压浓缩、活性炭层析柱预处理、层析纯化2’-岩藻糖基乳糖、低温减压浓缩、冷冻干燥得成品，成品色谱纯度85.04%。

7、上述专利的缺陷在于，转化率低，非目标糖干物质占比高，不利于分离纯化；同时对于2’-fl发酵液的分离纯化研究较少，且工艺路线较长，设备复杂。

8、二岩藻糖基乳糖（dfl）是一种存在于2’-岩藻糖基乳糖产品中的低聚糖，含量较低，具有多种生物活性，包括益生元作用、抗粘附性能和免疫调节功能，可作为人乳寡糖标准品，现有技术中一般采用合成的方式制备，产率低和产品纯化困难，现有技术中未见有发酵生产2’-岩藻糖基乳糖联产二岩藻糖基乳糖的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术转化率低、工艺流程长等问题，本发明提供一种大肠杆菌k-12mg1655 blbyzt6及其应用，提高了2’-岩藻糖基乳糖产率，降低非目标产物干物质占比，分离纯化流程简单，更利于工业化生产，同时可联产纯度90%以上的二岩藻糖基乳糖（dfl）。

2、第一方面，本发明提供一种大肠杆菌（ escherichia coli）k-12 mg1655 blbyzt6，该大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.28317，保藏日期为2023年08月31日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。领域内公知，大肠杆菌（ escherichia coli），又名大肠埃希氏菌，由escherich在1885年发现。

3、进一步的，大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6的培养方法为，将菌株接种于种子液培养基上，在温度为36~38℃、搅拌速率为150~250r/min条件下发酵培养5~10h；种子液培养基按如下浓度的成分配制：复配蛋白胨 8～14g/l、酵母粉 4～12g/l、氯化钠 8～12g/l；复配蛋白胨包括重量比为2~3：1的胰蛋白胨和牛骨蛋白胨。

4、第二方面，本发明提供大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6的应用，该应用为，在发酵生产2’-岩藻糖基乳糖及二岩藻糖基乳糖中的应用。

5、进一步的，发酵生产2’-岩藻糖基乳糖及二岩藻糖基乳糖的方法包括如下步骤：

6、（1）将大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6接种于种子液培养基，获得种子液；

7、（2）将种子液接种于发酵培养基进行发酵，获得发酵液；

8、（3）发酵液经膜过滤、浓缩、乙酸结晶、离心后固形物干燥得2’-岩藻糖基乳糖晶体，乙酸结晶分离液经脱色、离子交换、浓缩、色谱分离、干燥后得二岩藻糖基乳糖。

9、进一步的，步骤（2）中，发酵培养基按如下浓度的成分配制：葡萄糖 5~40g/l、乳糖5~40g/l、复配蛋白胨 10～15g/l、酵母粉 20～30g/l、磷酸氢二钾 10～20g/l、磷酸二氢钾1～5g/l、微量金属元素 5~15ml/l；微量金属元素包括如下浓度的成分，硫酸亚铁 6g/l、一水硫酸锰 0.35g/l、七水硫酸锌 2.2g/l、无水硫酸铜 1.0g/l、钼酸铵 0.11g/l。

10、进一步的，步骤（2）中，发酵的工艺条件为，首先调发酵温度为36~38℃，发酵压力为0.03~0.04mpa，发酵ph为6.8~7.0，发酵时间为8~10h；然后调发酵温度至28~32℃，发酵压力为0.05~0.08mpa，发酵ph为7.2~7.6，发酵过程中补加蛋白胨、乳糖和葡萄糖；整个发酵时间为100~130h，搅拌速率为150~300r/min。

11、进一步的，步骤（3）中，浓缩的温度≤70℃，发酵液浓缩至固形物含量＞83%。

12、进一步的，步骤（3）中，乙酸结晶的温度为恒温50℃，乙酸的添加量为料液质量的0.5~3倍，结晶的时间为30~50h。

13、进一步的，步骤（3）中，离心后固体物经过溶解、脱色、离子交换、浓缩、干燥得2’-岩藻糖基乳糖粉末，离子交换采用阳、阴离子树脂混合的满床式离子交换，阳离子树脂和阴离子树脂为体积比为100：110的d001树脂和d301-f树脂。d001树脂为阳离子强酸树脂，d301-f树脂为阴离子弱碱树脂，可避免过酸过碱对料液影响，保持料液稳定性。

14、进一步的，步骤（3）中，活性炭用量为料液干物质含量的3%~5%，脱色温度为50~60℃，脱色时间为50~70min，料液透光＞85%；离子交换进料温度为30~40℃，走料速度为2~3bv/h，出料电导＜50us/cm，出料ph值为3~6；浓缩温度为60~67℃，浓缩至固形物含量为50%；色谱分离条件为，色谱进料质量浓度为50%，温度为60~63℃，水料比为1:（3~3.5）。

15、本发明的有益效果在于：

16、（1）本发明以大肠杆菌k-12 mg1655 blbyzt6菌株高效发酵生产2’-岩藻糖基乳糖，发酵过程采用两段式，包括变温、变压及调控ph，第一段发酵工艺的温度、压力及ph为菌种最适宜的长菌条件，有利于快速长菌；第二段发酵工艺，采用降低温度至菌株最适反应温度，同时调整压力、ph，并补加氮源和碳源，提高目标反应产物产生，降低副产物的干物质面积占比，降低后提取难度。

17、（2）本发明发酵液经浓缩、乙酸结晶、离心即得到纯度＞96%的2’-岩藻糖基乳糖晶体，同时本发明可进一步精制得到高品质2’-岩藻糖基乳糖粉末，缩短了后提取工艺路线。

18、（3）本发明对发酵浓缩液采用乙酸代替现有技术中水结晶，可以实现2’-岩藻糖基乳糖一次结晶收率65%以上。

19、（4）本发明对结晶离心的分离液进行提纯，实现了联产制备出纯度＞90%的二岩藻糖基乳糖（dfl）。