一种基于DNA程序化组装的抗原拓扑组装体及亚单位疫苗、制备方法和应用

本发明属于生物制品，具体涉及一种基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体及亚单位疫苗、制备方法和应用。

背景技术：

1、蛋白亚单位疫苗具有多个优点，包括安全性高、易于制备和免疫效应稳定等，已成功应用于包括流感、乙型肝炎、人乳头瘤病毒(hpv)以及covid-19等在内的防控。尽管如此，由于只是以病原体的一部分蛋白作为抗原，亚单位疫苗的免疫原性相对较弱。除了蛋白抗原的化学组成和构象这类难以人为控制的因素外，抗原的物理性质也是影响其免疫原性的重要因素，比如，通常呈聚合状态抗原比单体抗原的免疫原性强很多。由于亚单位疫苗具有成熟的研发管线，深入研究影响病毒亚单位免疫原性的物理因素对于发展更为高效的亚单位疫苗具有重要意义。然而，长期以来缺少合适的工具来系统和深入地对上述问题进行研究。

2、近年来，结构dna纳米技术逐渐成为在纳米尺度上实现物质精确空间排布提供无可比拟的工具。相比于蛋白质自组装体(例如转铁蛋白)，dna纳米结构独特的可寻址性使得与dna偶联的小分子，蛋白以及纳米颗粒等可以通过特异性的dna杂交反应在dna纳米结构表面以精确的拷贝数进行定点组装。基于此原理，近期一项利用dna折纸精确排布hiv抗原的研究在体外环境下系统探究了抗原拷贝数、抗原间距，以及抗原载体的形貌对b细胞活化初始信号强度(钙离子内流)的影响，为高效亚单位疫苗的研发提供了一定理论依据。然而，b细胞活化不仅需要抗原诱导b细胞受体交联，还需要活化的cd4阳性t细胞为其提供cd40配体，体外基于dna折纸的模型研究难以说明活体内nanoscaleparametersofantigenorganization对其免疫原性的影响。

3、此外，目前通常会使用小分子交连剂，例如smcc、spdp、nhs-dbco往蛋白表面的氨基上偶联单链dna，进而实现蛋白在dna纳米结构表面的定点组装。这种方式用于抗原可控组装一方面可能会对抗原表面的b细胞表位造成破坏，另一方面由于偶联在抗原表面的dna数量不可控，会造成最终产物的产率低和均一性差。而且dna纳米结构高昂的制造成本也会给基于dna结构的亚单位疫苗造成极大限制。因此，发展普遍适用的经济高效、均一性好且对表位无损伤的抗原程序化组装方式，对于在探究影响病毒亚单位免疫原性的物理因素，并推动基于dna自组装的新型亚单位疫苗的转化应用具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，在保证抗原表位不受影响的情况下还能维持稳定的免疫效果。

2、本发明提供了一种基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，若干条偶联有病原体蛋白抗原的dna片段自组装得到。

3、优选的，所述病原体蛋白抗原和dna片段通过halo-tag和haloligand的偶联实现。

4、优选的，所述抗原拓扑组装体包括分枝状连接的拓扑组装体和线性连接的拓扑组装体。

5、优选的，所述分枝状连接的拓扑组装体是由分枝状连接的dna结构与偶联有病原体蛋白抗原的dna链杂交得到；

6、所述分枝状连接的dna结构是由3～7个dna手臂链自组装得到。

7、优选的，所述dna手臂链包括以下dna序列：7arm-1、7arm-2、7arm-3、7arm-4、7arm-5、7arm-6、7arm-7、6arm-5、5arm-4、4arm-3和3arm-3；

8、所述7arm-1、7arm-2、7arm-3、7arm-4、7arm-5、7arm-6、7arm-7、6arm-5、5arm-4、4arm-3和3arm-3的核苷酸序列依次如seq id no:1～seq id no:11所示。

9、优选的，所述线性连接的拓扑组装体是由线性连接的dna结构与偶联有病原体蛋白抗原的dna链杂交得到；

10、所述线性连接的dna结构是由2～7个具有伸出序列互补链、1条长dna单链和0～5条无伸出序列的dna替换链自组装得到。

11、优选的，所述长dna单链的核苷酸序列如seq id no:12所示；

12、所述具有伸出序列互补链包括以下dna序列：l1-c、l2-c、l3-c、l4-c、l5-c、l6-c和l7-c；

13、所述l1-c、l2-c、l3-c、l4-c、l5-c、l6-c和l7-c的核苷酸序列依次如seq id no:13～seq id no:19所示；

14、所述无伸出序列的dna替换链的核苷酸序列如seq id no:20～seq id no:24。

15、优选的，所述病原体包括以下至少一种：细菌、真菌、病毒、支原体和衣原体；

16、优选的，所述病毒包括新型冠状病毒；

17、优选的，新型冠状病毒抗原包括rbd蛋白。

18、本发明提供了一种防治病原体感染的亚单位疫苗，包括所述抗原拓扑组装体和佐剂。

19、本发明提供了所述亚单位疫苗在制备预防病原体感染或在制备阻断病原体感染的药物中的应用。

20、本发明提供的基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，是若干条偶联有病原体蛋白抗原的dna片段通过自组装得到。本发明通过体外b细胞活化研究和活体免疫效果评价，结果表明，随着抗原价态升高能诱导小鼠体内产生更高的抗体滴度，超过4价以后抗体滴度维持恒定。所述抗原拓扑组装体向淋巴结富集效果，稳定性以及在活体内诱导cd4阳性t细胞活化效果没有显著差异，证明的确是抗原空间组织对体液免疫效果发挥主要影响。该研究为新型高效病毒亚单位疫苗构建提供了理论支撑和普遍适用的策略。

21、本发明提供的抗原拓扑组装体，以经过合理序列设计的dna链为组装单元自组装形成dna纳米结构，通过碱基互补配对实现单dna-抗原蛋白在dna纳米结构上的精确组装。本发明基于halo-tag的蛋白抗原单根dna共价标记技术，将携带halo-tag的抗原与一端修饰haloligand的dna片段以1:1的化学计量比偶联，得到高效的rbd单dna标记。

22、本发明提供的抗原拓扑组装体包括分枝状连接的拓扑组装体和线性连接的拓扑组装体，得到不同价态的抗原线性连接和分枝状连接的拓扑组装体。实验证明，分枝状连接的拓扑组装体诱导产生的抗体滴度比线性连接的拓扑组装体高出约10倍。同时本发明实验还证实分枝状连接的拓扑组装体中的抗原与抗原特异性b细胞结合力更高，并能诱导产生更强的b细胞受体活化信号，这可能是星形分布的rbd能够在活体内引起更高抗体滴度的原因。

技术特征：

1.一种基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，若干条偶联有病原体蛋白抗原的dna片段自组装得到。

2.根据权利要求1所述基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，所述病原体蛋白抗原和dna片段通过halo-tag和halo ligand的偶联实现。

3.根据权利要求1所述基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，所述抗原拓扑组装体包括分枝状连接的拓扑组装体和线性连接的拓扑组装体。

4.根据权利要求3所述基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，所述分枝状连接的拓扑组装体是由分枝状连接的dna结构与偶联有病原体蛋白抗原的dna链杂交得到；

5.根据权利要求4所述基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，所述dna手臂链包括以下dna序列：7arm-1、7arm-2、7arm-3、7arm-4、7arm-5、7arm-6、7arm-7、6arm-5、5arm-4、4arm-3和3arm-3；

6.根据权利要求3所述基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，所述线性连接的拓扑组装体是由线性连接的dna结构与偶联有病原体蛋白抗原的dna链杂交得到；

7.根据权利要求6所述基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，所述长dna单链的核苷酸序列如seq id no:12所示；

8.根据权利要求1～7任意一项所述基于dna程序化组装的抗原拓扑组装体，其特征在于，所述病原体包括以下至少一种：细菌、真菌、病毒、支原体和衣原体；

9.一种防治病原体感染的亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求1～8中任意一项所述抗原拓扑组装体和佐剂。

10.权利要求9所述亚单位疫苗在制备预防病原体感染或在制备阻断病原体感染的药物中的应用。

技术总结
本发明提供了一种基于DNA程序化组装的抗原拓扑组装体及亚单位疫苗、制备方法和应用，属于生物制品技术领域。一种DNA引导的抗原表位非破坏性方法与DNA纳米技术结合有效地将SARS‑CoV‑2的受体结合域(RBD)以可控的抗原价排列成线形和星形两种不同的拓扑结构。本发明通过对活体免疫效果的评价可知，RBD诱导的小鼠IgG滴度随着抗原价数的增加而增加，在四价后达到稳定水平，此时，星形RBD诱导的滴度比线形RBD高约十倍。机制研究表明，星形RBD引发更强的B细胞增殖，这可能是由于抗原‑受体和受体‑受体协同相互作用增强，星形RBD和B细胞之间的结合增强导致的，强调了抗原拓扑结构对体液免疫效果发挥重要性。

技术研发人员：孙乐乐,曲彦霏,张亚玲,沈枫韵
受保护的技术使用者：上海大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22