改善高温下稻米品质表现的Wx自然变异位点及其应用

本发明涉及一种改善高温下稻米品质表现的wx自然变异位点及其应用，属于作物遗传育种、作物品质改良新资源创新、高温抗性且品质优良作物育种领域。

背景技术：

1、水稻(oryza sativa l.)是世界上最主要的粮食作物之一，我国有超过60％的人口以大米为主食。尽管目前的水稻生产水平能够解决人们的吃饭问题，但是随着生活水平的提高，人们倾向于选择口感好、食味佳、易咀嚼及好吸收的优质稻米。

2、水稻正常的生长发育要求适宜的环境温度，超过35℃的高温会对水稻生长发育造成严重的危害。气候变暖已经成为全世界关注的环境问题，频繁发生的夏季极端高温天气不仅影响水稻的产量同时导致稻米品质的降低，具体表现为稻米垩白升高和蒸煮食味品质的降低。

3、淀粉作为稻米胚乳的主要成分，其含量和组成尤其是wx基因所控制的直链淀粉含量是决定稻米的关键因素，自然界存在大量的wx等位基因，wxa和wxb是wx基因的两种常见的等位型，二者的cdna编码区仅在ex10-115位点存在t/c单碱基差异，且二个等位基因表达及其控制的直链淀粉合成存在显著差异。相比于wxb，wxa基因的表达及其控制的直链淀粉含量在高温下更稳定。

4、国际上已经有通过常规育种方式实现改良稻米品质或者提高水稻高温抗性的例子。稻米品质改良育种经常通过wx优异自然等位变异的利用来实现，如籼稻品种特青由于直链淀粉含量过高所以品质较低，育种者将其wxa基因替换成wxb，从而达到提高稻米蒸煮食味品质的目标。至于抗高温水稻的育种工作更多集中在耐高温水稻种质的筛选及相关基因资源的挖掘和利用，如日本育种者将籼稻habataki来源的apg1等位基因导入越光水稻，能够提高稻米在高温胁迫条件的品质表现。这种常规育种方式选育周期长，难以及时应对已经频繁出现的夏季极端高温天气对稻米品质的影响，而且一些高温抗性基因/qtls的导入对抗性以外的生理性状往往也存在一定的影响，鉴定品质形成关键基因中响应高温的关键snp位点并应用于高温抗性优质水稻的育种则更具方向性。

5、随着基因编辑技术的日益发展和完善，crispr/cas9(crispr-associatedprotein 9)系统已经成功应用于作物遗传改良，相比于传统育种，基因编辑育种不仅效率高、周期短，还可以精准、定向、规模化创制预期的目标基因。通过对玉米进行基因编辑创制了wx基因突变的糯性玉米材料，目前已经进入田间试验阶段。品质改良育种研究中针对wx基因进行突变编辑的适用范围十分有限，而通过基因编辑创制wx基因新等位变异显然更可能实现微调wx基因表达和直链淀粉含量进而达到改良稻米品质的目标。be3单碱基编辑系统包含的a3b-ctd脱氨酶(apobec3b胞苷脱氨酶)偏好于对tc位点的编辑，能够在不诱导双链断裂的情况下在基因组靶位点产生c到t的单核苷酸替换。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有高温钝性优质水稻育种技术的不足(育种周期长和工作量大等)，提供一个改善高温下稻米品质表现的wx自然变异位点及其应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：促进高温下稻米品质稳定性的水稻wx自然变异位点，其特征是：位于wx基因第十号外显子115位核苷酸(ex10-115)，存在c/t自然变异；该变异位点与高温下wx基因编码的gbssi蛋白和直链淀粉合成的稳定性以及稻米外观密切相关。

3、所述的水稻wx自然变异位点，wx基因组dna序列如seq id no:1(wxb)和seq idno:2(wxa)；

4、wx基因组氨基酸序列如seq id no:3(wxb)和seq id no:4(wxa)。

5、利用所述的水稻wx自然变异位点在水稻品质改良、品系品种创制和/或选育方面的应用。

6、获得高温条件下直链淀粉含量稳定且稻米外观优良的品质和高温抗性协同改良水稻的方法，使wxb型水稻材料中针对权利要求1或2所述的水稻wx等位变异位点进行c到t的突变。

7、一种利用基因编辑创制高温条件下种子直链淀粉含量稳定、种子外观更优的品质和高温抗性改良水稻的育种方法，包括以下步骤：

8、1)、wx基因编辑的靶位点设计；基因编辑的wx基因靶位点核苷酸序列如seq idno:5所示；

9、2)、含有目的片段的单碱基编辑载体的构建；具体为：

10、2-1)、靶点接头片段制备：利用基因组编辑在线软件工具targetdesign设计包含wxb第10号外显子115碱基的靶点序列，靶点序列为seq id no:5，在其正向和反向互补5'端添加ggca和aaac(seq id no:6和seq id no:7)后退火形成带有粘性末端的片段；

11、2-2)、将退火后的靶点片段连入载体ph-a3bctd-vhm-pbe(bsa i酶切位点，载体由apobec3b胞嘧啶脱氨酶截短后的a3bctd与ncas9蛋白融合而来)中；载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入日本晴水稻愈伤，经过一些列组织培养获得转化植株；

12、3)、具备权利要求1或2所述的突变型蛋白、权利要求3或4所述的高温条件下直链淀粉含量稳定、外观优良的品质和和高温抗性改良水稻的t0代植株获得；

13、4)、将目标基因突变的t0代转基因植株自交获得的t1代植株的t-dna片段剔除；

14、5)、t-dna得到剔除的t1代植株基因型再鉴定并获得目标基因纯合突变植株。

15、步骤4)中，t-dna片段包括潮霉素磷酸转移酶基因hpt和核酸酶基因ncas9。

16、步骤4)中，t-dna片段的剔除，通过对目标基因突变的t0代转基因植株自交获得t1带植株的hpt基因和ncas9基因同时检测，重复多次，筛选得到不携带这两个基因的t1带单株即为目标植株。

17、所述hpt基因检测方法通过以目标基因突变的t0代转基因植株自交获得的t1代植株的基因组dna为模板，以hyg283-f(seq id no:8)和hyg283-r(seq id no:9)为引物进行pcr扩增，，同时，所述ncas9基因检测方法通过以目标基因突变的t0代转基因植株自交获得的t1带植株的基因dna为模板，以ncas9-f(seq id no:10)和ncas9-r(seq id no:11)为引物进行pcr扩增，当均为同时检测不到hpt基因和ncas9基因，表明成功剔除了t-dna。

18、步骤5)中，目标基因纯合突变植株的获得，是将步骤4)获得的t-dna剔除的t1代植物进行基因组dna提取，以wxb-pcr-f(seq id no:12)和wxb-pcr-r(seq id no:13)为引物进行pcr扩增并测序，从中筛选并获得纯合的、具备权利要求1或2所述的突变型蛋白、权利要求3或4所述的核酸或基因的植株。

19、鉴定上述方法获得的植物的方法，包括以下步骤：测定经过灌浆期高温处理后植物直链淀粉含量是否更稳定；

20、和/或

21、测定经过灌浆期高温处理后植物稻米外观是否更好，精米垩白度是否更低。

22、本发明方法科学合理，通过本发明，针对现有高温钝性优质水稻育种技术的不足(育种周期长和工作量大等)，提供一个改善水稻高温品质表现的wx自然变异位点，本发明的另一目的是提供该wx自然变异位点及其编辑应用。

23、一个控制稻米高温品质表现的wx等位变异位点，所述位点位于wx基因第十号外显子115位核苷酸(ex10-115)，存在c/t自然变异。wxa基因的ex10-115位点为胸腺嘧啶t，而其它所有的wx等位基因的ex10-115位点均为胞嘧啶c，t/c变异导致了该位点编码的氨基酸从丝氨酸突变成脯氨酸。高温条件下ex10-115t型水稻比ex10-115c型水稻的gbssi蛋白稳定性更强，稻米直链淀粉含量更稳定。

24、利用基于crispr的基因组编辑软件工具targetdesign选择编辑窗口包括wxb第10号外显子靠近第115位碱基的靶点序列，在其正向和反向互补5'端添加ggca和aaac，退火形成带有粘性末端的小片段。利用be3单碱基编辑系统，连入载体ph-a3bctd-vhm-pbe(bsa i酶切位点，载体由apobec3b胞嘧啶脱氨酶截短后的a3bctd与ncas9蛋白融合而来)中。载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入日本晴(npb)水稻愈伤，经过一些列组织培养获得转化植株。

25、wx是控制稻米直链淀粉含量的关键基因，本发明公开了一个控制水稻直链淀粉含量高温敏感性的wx位点，该位点位于wx基因第十号外显子115位核苷酸(ex10-115)，存在c/t自然变异。wxa基因的ex10-115位点为胸腺嘧啶t，而其它所有的wx等位基因的ex10-115位点均为胞嘧啶c，t/c变异导致了该位点编码的氨基酸从丝氨酸突变成脯氨酸。ex10-115位点为c的wxa型gbssi蛋白的高温稳定性比wxb型gbssi蛋白更强，所控制合成的直链淀粉含量在高温下也更稳定。利用crispr/cas9技术将日本晴(npb)中wxb基因ex10-115位点的c定点编辑为t能够显著提高稻米直链淀粉含量的高温稳定性，并且改善稻米在高温下的外观表现。