用于双重检测红薯源和玉米源成分的LMTIA引物探针及其用途

本发明属于生物分子检测，具体而言，本发明涉及用于双重检测红薯源成分和玉米源成分的引物探针，用于快速双重检测红薯源性成分和玉米源成分的试剂盒，以及红薯源性成分和玉米源成分的特异性引物和探针在双重检测样品中红薯源性成分和玉米源成分中的应用。

背景技术：

1、红薯原名番薯，又名蕃薯、番芋、红苕、甘薯、地瓜等。红薯富含蛋白质、纤维素、糖、脂肪、维生素等多种人体所需营养物质和丰富的必需微量元素。此外，红薯还含有甘薯多糖、甘薯蛋白、多酚和黄酮等多种活性物质，被誉为“天然绿色食品”和“长寿食品”，居绿色蔬菜之首。红薯淀粉是农作物中营养种类多，综合营养价值高的食品之一。红薯淀粉可用于制备淀粉糖浆和葡萄糖，主要用于粉丝和粉条的加工，尤其是河北、河南、山东地区，淀粉深加工呈现规模化，有些产品已出口日本、韩国等国家。红薯已经上升为食品工业的主要优质原料，在国际上都享有盛誉，这也给中国的红薯粉条产业带来了巨大的市场契机。

2、玉米是常用的粮食作物，在世界农业生产中占据着重要地位。由于玉米淀粉的价格比红薯淀粉低很多，所以很多不法商人为获取假货带来的暴利向粉条里添加玉米淀粉，用玉米淀粉制作所谓的“纯红薯粉条”，为让色泽形似、口感筋道，甚至添加墨汁和工业用料石蜡等违规添加剂。目前为检测红薯粉条中含有的有害物质以及判断其真假，已经有很多种确定红薯淀粉中是否混掺玉米淀粉的检测方法被建立，包括淀粉遇碘制剂呈现不同的显色反应、扫描电镜、激光粒度分析仪、快速黏度分析仪和x-射线衍射仪等。

3、现代分子生物技术以其方便、快速、准确等特点，从基因水平分析原料和产品的来源与特性，特异性强、灵敏度高，在食品种类鉴别、产地溯源等食品真伪鉴别研究中得到了广泛应用。新型核酸等温扩增技术——梯型熔解温度等温扩增(ladder-shapemeltingtemperature isothermalamplification，lmtia)技是一种扩增效率高、无需专门的仪器的核酸扩增方法，在60-65℃恒温的条件下即可实现核酸的扩增。proofman探针是根据lmtia的环引物lf所设计，在proofman探针的3’端设计1个错配碱基，将荧光基团标记在该错配碱基上，猝灭基团标记在探针的5’端。在超保真dna聚合酶的作用下切除错配碱基，释放荧光基团，通过收集荧光信号即可对目标物质进行检测。

4、目前尚未见有采用proofman荧光探针与lmtia体系相结合，通过一次反应即可同时、双重检测红薯性成分和玉米源成分的文献公开，且整个反应过程在20min内完成。国内外尚未见报道能够双重、快速、简便、特异且灵敏地检测淀粉、粉条等样品中红薯源性成分和玉米源成分的方法和试剂盒。

5、因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的红薯源性成分和玉米源成分的检测方法，进行淀粉或淀粉加工食品中红薯源性成分和玉米源成分的双重检测。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供用于检测红薯源成分和玉米源成分的lmtia引物探针，可用于双重检测淀粉或淀粉加工食品是否含有红薯源成分和玉米源成分，具体的技术方案如下：

2、所述红薯引物探针的序列为：

3、hs-f3：5`-cccgaggcatgcgcttttcgaccagagaacgcgtttgt-3`

4、hs-b3：5`-acccccggcgcgttttcgatattccttggcgcgttc-3`

5、hs-3lf：5`-cggacgaggagattgaatt-3`

6、hs-探针：5'-bhq1-cggacgaggagattgaatc-3'-joe。

7、所述玉米引物探针的序列为：

8、ym-f2：5`-acctggggtcgcggtttttattcggccctaaggacccat-3`

9、ym-b2：5`-ccccaggtcagtcgggttttatatgcttaaactcagcggg-3`

10、ym-2lf：5`-ggcaagctcggtcgct-3`

11、ym-探针：5'-bhq1-ggcaagctcggtcgcc-3'-fam。

12、本发明的第2个目的是提供用于双重检测红薯源成分和玉米源成分的试剂，具体的技术方案为：包括dntps、bst酶的通用型反应预混液和如上所述的lmtia引物探针。

13、本发明的第3个目的在于提供用于双重检测红薯源成分和玉米源成分的试剂盒，具体的技术方案为：包括如上所述的用于检测红薯源成分和玉米源成分的lmtia引物探针或如上所述的用于检测红薯源成分和玉米源成分的试剂。

14、本发明的第4个目的在于提供用于双重检测红薯源成分和玉米源成分的方法，具体的技术方案为：包括如下步骤：(1)提取样品dna；(2)采用如上所述的lmtia引物探针或包含所述lmtia引物探针的试剂或包含所述lmtia引物探针的试剂盒配制lmtia反应体系；(3)将配制好的lmtia反应体系置于实时荧光pcr仪或水浴锅中进行恒温扩增；(4)扩增20min后观察扩增曲线。

15、优选的，所述提取样品dna的方法参照植物dna提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)；所述提取植物淀粉、粉条等市售样品dna方法参照nucleo试剂盒(德国macherey-nagel公司)。

16、优选的，所述恒温扩增的温度为61℃。

17、优选的，所述lmtia反应体系中红薯引物探针hs-f3：hs-b3：hs-3lf：hs-探针的摩尔比为4:4:1:1；所述lmtia反应体系中玉米引物探针ym-f2：ym-b2：ym-2lf：ym-探针的摩尔比为4:4:1:1；

18、本发明的目的还在于上述用于检测红薯源成分和玉米源成分的lmtia引物探针试剂/试剂盒在检测红薯源成分和玉米源成分中的应用。

19、优选的，上述用于检测红薯源成分和玉米源成分的lmtia引物探针/试剂/试剂盒在检测淀粉或淀粉加工食品中红薯源和玉米源成分中的应用。

20、本发明的有益效果是：本发明的用于检测红薯源成分和玉米源成分的lmtia引物探针具有良好的特异性和灵敏度，在恒温条件下即可实现对样品中红薯成分和玉米成分的双重检测。

21、本发明的lmtia引物探针的红薯源成分的绝对灵敏度可达10pg/μl，相对灵敏度可达1％。

22、玉米源成分的绝对灵敏度可达1pg/μl，相对灵敏度可达1％。

23、本发明的检测红薯源成分和玉米源成分的方法简单、快速，61℃恒温反应20min左右即可获取检测结果。

24、本发明的lmtia引物探针可用于同时检测粉条、淀粉的红薯源成分和玉米源成分。

技术特征：

1.用于双重检测红薯源和玉米源成分的lmtia引物探针，其特征在于，所述引物探针的序列为：

2.根据权利要求1所述的引物探针，其特征在于，红薯hs-探针的5’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，3’端连接有一个荧光报告基团joe。

3.根据权利要求1所述的引物探针，其特征在于，玉米ym-探针的5’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，3’端连接有一个荧光报告基团fam。

4.用于双重检测红薯源和玉米源成分的试剂，其特征在于，包括dntps和bst酶的通用型lmtia反应预混液和如权利要求1所述的lmtia引物探针。

5.用于双重检测红薯源和玉米源成分的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的latia引物探针或如权利要求4所述的用于检测红薯源和玉米源成分的试剂。

6.一种检测红薯源和玉米源成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样品dna；(2)采用如权利要求1-3任一项所述的lmtia引物探针或如权利要求4所述的试剂或如权利要求5所述的试剂盒配制lmtia反应体系；(3)将配制好的lmtia反应体系置于实时荧光pcr仪进行恒温扩增；(4)扩增20min后观察扩增曲线。

7.根据权利要求6所述的检测红薯源成分和玉米源成分的方法，其特征在于，所述恒温扩增的温度为61℃。

8.根据权利要求6所述的检测红薯源成分和玉米源成分的方法，其特征在于，所述lmtia反应体系中红薯引物探针hs-f3：hs-b3：hs-3lf：hs-proofman探针的摩尔比为4:4:1:1；所述lmtia反应体系中玉米引物探针ym-f2：ym-b2：ym-2lf：ym-proofman探针的摩尔比为4:4:1:1。

9.根据权利要求1-3任一项所述的lmtia引物探针的用途，其特征在于，在检测红薯源和玉米源成分中的应用。

10.根据权利要求9所述的lmtia引物探针的用途，其特征在于，在检测淀粉或淀粉加工食品中红薯源成分和玉米源成分中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于双重检测红薯源和玉米源成分的LMTIA引物探针及其应用。所述的用于双重检测红薯源和玉米源成分的LMTIA引物探针包括Hs‑F3引物、Hs‑B3引物、Hs‑3LF引物和红薯荧光探针以及Ym‑F2引物、Ym‑B2引物、Ym‑2LF引物和玉米荧光探针；包含本发明的LMTIA引物探针的检测体系具有良好的特异性和灵敏度，能同时、双重、快速、简便、高效的检测样品中是否含有红薯源成分和玉米源成分，可应用于淀粉或淀粉加工食品的快速准确检测。

技术研发人员：崔鹏飞,王德国,王博锐,许丹丹,刘金鑫,肖付刚,胡桢晴,郭梦如
受保护的技术使用者：许昌学院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19