一种鉴别中国甜柿基因型的方法

本发明涉及分子生物学。具体地说是一种鉴别中国甜柿基因型的方法。

背景技术：

1、柿(diospyros kaki thunb.)为柿科(ebenaceae)柿属(diospyros)植物，有“木本粮食”之称。柿果肉中含有一类特化的单宁细胞，其液泡内含有的大量原花青素(proanthocyanindins,pas；俗称“柿单宁”)是导致其产生涩感的主要原因。根据果实成熟时在树上自然脱涩与否及其性状遗传特点，现有柿品种可分为完全甜柿(pcna)和非完全甜柿(non-pcna)。完全甜柿是非完全甜柿的一种自然突变，由于其果实成熟时采收后无需任何处理即可食用，是目前柿产业发展和遗传改良的主要目标。

2、我国拥有世界上最为丰富的柿种质资源，除大别山区有少数中国甜柿资源外，其余均为涩柿。中国甜柿(cpcna)为完全甜柿类型，在果实硬食期即可自然脱涩，其自然脱涩机理以单宁的凝固效应为主，有别于日本甜柿的稀释效应。中国原产完全甜柿内部遗传多样性丰富，且控制自然脱涩性状相关基因为显性，而日本原产完全甜柿(简称“日本甜柿”)受隐性基因控制，即中国甜柿的杂交后代中就能够产生完全甜柿，日本甜柿必须和日本甜柿之间杂交才能获得完全甜柿，但面临近亲衰退。因此，中国甜柿较日本甜柿具有更重要的育种价值。

3、目前，中国甜柿的自然脱涩基因的数量不清楚，育种有一定的盲目性。因此，鉴别中国甜柿的基因型，能为杂交亲本的选择提供参考，而且将基因型用于幼株的胚拯救、绿木嫁接和标记辅助选择的杂交组合，将大大提高pcna育种的效率，对育成具知识产权的完全甜柿新品种具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在提供一种鉴别中国甜柿基因型的方法，为选育以中国甜柿为亲本的杂交后代提供基因型参考。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

3、一种鉴别中国甜柿基因型的方法，包括以下步骤：

4、s1、选取中国甜柿标准样品，提取标准样品的基因组dna，分别利用ro2标记引物和参考基因引物进行qpcr扩增，得到不同dna浓度下的ct值；

5、s2、利用标准样品在不同dna浓度下的ct值建立标准曲线，所述标准曲线包括独立的ro2标准曲线和参考基因标准曲线；

6、s3、参照s1，获取待测柿材料在同一dna浓度下但不同引物条件下的ct值，根据s2所述标准曲线，计算得到待测柿材料的基因型。

7、在上述方法中，ro2是与cpcna显性等位基因强连锁的scar标记；本发明利用qpcr检测中ct值与dna浓度呈线性关系，通过标准曲线下dna浓度与ct值的关系计算中国甜柿中的cpcna相对等位基因剂量，从而确定中国甜柿的基因型。

8、优选地，在上述方法中，所述ro2标记引物的序列如seq id no.1～2所示。

9、优选地，在上述方法中，所述参考基因为dkact、dkanr、l5r中的至少一个；其中，所述dkact的引物序列如seq id no.3～4所示，所述dkanr的引物序列如seq id no.5～6所示，所述l5r的引物序列如seq id no.7～8所示。

10、优选地，在上述方法中，采用中国甜柿‘罗田甜柿’作为标准样品。

11、优选地，在上述方法中，步骤s3假设标准样品中含有1个cpcna等位基因，并将标准样品的基因型记为bbbbbb，且通过以下公式计算待测柿材料的cpcna相对等位基因剂量：

12、

13、式中，ro2的相对dna用量由待测柿材料利用ro2标记引物进行qpcr扩增得到的ct值代入ro2标准曲线计算得到，参考基因的相对dna用量由待测柿材料利用参考基因引物进行qpcr扩增得到的ct值代入参考基因标准曲线计算得到；cpcna相对等位基因剂量表明了待测柿材料相对于标准样品的cpcna相对等位基因的量。

14、根据待测柿材料的cpcna相对等位基因剂量，即可确认待测柿材料的基因型，具体为：当cpcna相对等位基因剂量小于0.5，待测柿材料的基因型为bbbbbb，当cpcna相对等位基因剂量大于等于0.5小于1.5，待测柿材料的基因型为bbbbbb；当cpcna相对等位基因剂量大于等于1.5小于2.5，待测柿材料的基因型为bbbbbb；依次类推。

15、优选地，在上述方法中，所述基因组dna提取自柿幼嫩叶片。

16、优选地，在上述方法中，所述基因组dna的提取方法为改良ctab法。

17、优选地，在上述方法中，利用琼脂糖凝胶及紫外分光光度计检测基因组dna样品的质量与浓度，样品检测合格后置于-20℃冰箱保存备用。

18、优选地，在上述方法中，步骤s1和s3所述的qpcr扩增的体系共10μl，且具体包括：5μlsybr premix，0.2μl的roxⅱ，10μm/l的上游引物和下游引物各0.4μl，基因组dna模板为1μl，ddh2o余量。

19、优选地，在上述方法中，所述基因组dna于95℃变性10min，且qpcr扩增的运行程序为：95℃预变性4min，95℃变性15s，57℃退火5s，72℃延伸19s，变性退火延伸共40循环，最后72℃延伸10min。

20、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

21、本发明假设在已知标准样品(如中国甜柿‘罗田甜柿’)基因型的基础上，通过设置浓度梯度的qpcr扩增标准曲线，计算出中国甜柿的基因型。实验结果表明，该方法的鉴定结果与peiet al.2012年标记鉴定结果一致，说明本发明方法能够鉴别中国甜柿基因型。相对于现有的鉴定方法，本发明操作简便、高效，对于柿种质资源及杂交后代的基因型鉴定中具有重要意义。

技术特征：

1.一种鉴别中国甜柿基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ro2标记引物的序列如seq id no.1～2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参考基因为dkact、dkanr、l5r中的至少一个；其中，所述dkact的引物序列如seq id no.3～4所示，所述dkanr的引物序列如seqid no.5～6所示，所述l5r的引物序列如seq id no.7～8所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准样品为‘罗田甜柿’。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，假设标准样品中含有1个cpcna等位基因，步骤s3采用以下公式进行计算：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当cpcna相对等位基因剂量小于0.5，待测柿材料的基因型为bbbbbb，当cpcna相对等位基因剂量大于等于0.5小于1.5，待测柿材料的基因型为bbbbbb；当cpcna相对等位基因剂量大于等于1.5小于2.5，待测柿材料的基因型为bbbbbb。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组dna提取自柿幼嫩叶片。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组dna的浓度采用紫外分光光度计检测。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1和s3所述的qpcr扩增的体系共10μl，且具体包括：5μl sybr premix，0.2μl的roxⅱ，10μm/l的上游引物和下游引物各0.4μl，基因组dna模板为1μl，ddh2o余量。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，所述基因组dna于95℃变性10min，且qpcr扩增的运行程序为：95℃预变性4min，95℃变性15s，57℃退火5s，72℃延伸19s，变性退火延伸共40循环，最后72℃延伸10min。

技术总结
本发明公开了一种鉴别中国甜柿基因型的方法，包括以下步骤：提取中国甜柿标准样品的基因组DNA，分别利用RO2标记引物和参考基因引物进行qPCR扩增，得到不同DNA浓度下的Ct值，利用标准样品在不同DNA浓度下的Ct值建立标准曲线，再获取待测柿材料在不同引物条件下的Ct值，根据标准曲线计算得到待测柿材料的基因型。本发明利用中国甜柿鉴别引物和参考基因引物对CPCNA进行qPCR扩增，并利用qPCR制作标准样品DNA浓度及Ct值的独立扩增标准曲线，根据标准曲线计算中国甜柿的CPCNA相对等位基因剂量，从而鉴定中国甜柿基因型。本发明方法对柿种质资源及杂交后代的基因型鉴定具有重要意义。

技术研发人员：陈文兴,游文娟,张青林,罗正荣,郭大勇,徐莉清
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15