一种靶向线粒体自噬的化合物高通量筛选方法

本发明属于药物筛选，具体涉及一种靶向线粒体自噬的化合物高通量筛选方法。

背景技术：

1、线粒体是真核细胞内具有双层膜结构的细胞器。它不仅是细胞的动力工厂，为细胞提供能量所需的大部分三磷酸腺苷，同时线粒体在氧化还原平衡，磷脂生物合成及转运、钙信号转导，细胞凋亡，先天性免疫反应及细胞分化等均具有重要作用。线粒体在发挥功能的过程中，会受到各方面的刺激，如呼吸链产生的活性氧(ros)、错误折叠蛋白的聚集、线粒体dna突变，而导致结构性或功能性的损伤。因此，线粒体的质量控制对于细胞维持正常的功能至关重要。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性地清除损伤线粒体的过程，是线粒体质量控制的主要机制之一，对线粒体网络的功能完整性十分关键。线粒体自噬失调与多种疾病的发生发展密切相关，如帕金森及阿尔茨海默症等神经退行性疾病、脂肪肝及糖尿病等代谢性疾病、心血管病及癌症等等。因此，寻找靶向线粒体自噬的化合物，为今后开发治疗这些慢性疾病的药物提供依据。

2、基于线粒体自噬的特性，通常分析线粒体组分(线粒体蛋白质或线粒体dna)的降低程度来反映线粒体自噬活性，常用方法为细胞免疫荧光技术及western blotting技术。然而，这些方法步骤繁琐、耗时耗力，不能作为高通量筛选方法分析各类化合物的线粒体自噬调控活性。因此，需要建立一种靶向线粒体自噬的化合物高通量筛选方法。

3、目前，所建立的线粒体自噬高通量筛选方法主要基于过表达外源定位线粒体的绿色荧光蛋白(mitogfp)在细胞内的含量来分析线粒体自噬活性。此方法可与crispr基因敲除文库相结合来筛选线粒体自噬相关调控基因，但无法实现高通量筛选靶向线粒体自噬的化合物。此外，过表达外源的mitogfp蛋白不能真实反映正常生理状态下的线粒体自噬活性。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现状及现有技术中存在的技术问题之一。

2、本发明第一方面的目的，在于提供nanoluc荧光素酶作为生物标志物在筛选线粒体自噬激动剂和/或线粒体自噬抑制剂中的应用。

3、本发明第二方面的目的，在于提供一种线粒体标记细胞。

4、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第二方面的线粒体标记细胞的构建方法。

5、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第二方面的线粒体标记细胞的应用。

6、本发明第五方面的目的，在于提供一种线粒体自噬激动剂和/或线粒体自噬抑制剂的筛选系统。

7、本发明第六方面的目的，在于提供一种药物筛选试剂盒

8、本发明第七方面的目的，在于提供一种靶向线粒体自噬的化合物的高通量筛选方法。

9、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

10、本发明的第一个方面，提供nanoluc荧光素酶作为生物标志物在筛选线粒体自噬激动剂和/或线粒体自噬抑制剂中的应用。

11、本技术首次采用分子量小、发光亮的nanoluc荧光素酶作为筛选标志物，将nanoluc荧光素酶插入到线粒体蛋白中，不会影响线粒体及细胞的正常功能，且能真实反映正常生理状态下的线粒体自噬活性，可用于高通量筛选靶向线粒体自噬的化合物，如线粒体自噬激动剂和/或线粒体自噬抑制剂。

12、本发明的第二个方面，提供一种线粒体标记细胞，所述线粒体标记细胞内源表达nanoluc荧光素酶和firefly荧光素酶。

13、在本发明一些实施方式中，所述nanoluc荧光素酶位于细胞内源atp5b蛋白的c端。

14、在本发明一些实施方式中，所述细胞包括hela细胞株、hela-atp5b-nanoluc细胞株、pink1敲除的sgpink1 hela-atp5b-nanoluc细胞株。

15、本发明的第三个方面，提供本发明第二方面的线粒体标记细胞的构建方法，包括以下步骤：(1)利用crispr基因编辑方法将nanoluc荧光素酶插入内源atp5b蛋白c端，构建了表达内源atp5b-nanoluc融合蛋白的细胞株；

16、(2)利用慢病毒载体将表达firefly荧光素酶dna片段插入步骤(1)表达内源atp5b-nanoluc融合蛋白的细胞株的细胞基因组中，得到线粒体标记细胞。

17、在本发明一些实施方式中，步骤(1)的过程具体包括以下步骤：表达靶向atp5b的c端的sgrna质粒、表达nanoluc荧光素酶及筛选标签puromycin抗性蛋白的universal donor质粒、表达靶向universal donor质粒的sgrna和cas9蛋白的质粒转染至过表达parkin蛋白的hela细胞即可。

18、本发明通过crispr基因编辑技术将nanoluc荧光素酶插入内源线粒体蛋白-atp5b蛋白c端，构建了表达内源atp5b-nanoluc融合蛋白的hela细胞株；在此基础上，利用慢病毒载体将组成性表达firefly荧光素酶的dna片段插入细胞基因组，构建了具有双荧光素酶报告系统的线粒体标记细胞(hela-atp5b-nanoluc细胞)。此细胞株具有正常线粒体功能、线粒体自噬活性、用于检测线粒体自噬活性的nanoluc荧光素酶标志物及用于内参校正的firefly荧光素酶，具备了高通量筛选靶向线粒体自噬的化合物的能力。

19、本发明的第四个方面，提供本发明第二方面的线粒体细胞在(a)～(e)中任一项中的应用：

20、(a)筛选靶向线粒体自噬的化合物；

21、(b)制备靶向线粒体自噬的化合物的产品；

22、(c)检测线粒体自噬活性；

23、(d)制备检测线粒体自噬活性的产品；

24、(e)构建药物筛选系统。

25、在本发明一些实施方式中，(a)中所述化合物包括线粒体自噬激动剂和/或线粒体自噬抑制剂。

26、本发明的第五个方面，提供一种线粒体自噬激动剂和/或线粒体自噬抑制剂的筛选系统，包括本发明第二方面的线粒体标记细胞。

27、本发明的第六个方面，提供一种药物筛选试剂盒，包括本发明第二方面的线粒体标记细胞或本发明第五方面的筛选系统。

28、在本发明一些实施方式中，所述药物筛选试剂盒还包括荧光素酶底物。

29、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括缓冲液和/或细胞培养板。

30、本发明的第七个方面，提供一种靶向线粒体自噬的化合物的高通量筛选方法，包括检测待筛选化合物对本发明第二方面的线粒体标记细胞检测反应的步骤；或包括使用本发明第五方面的筛选系统的步骤；或包括使用本发明第六方面的药物筛选试剂盒的步骤。

31、在本发明一些实施方式中，所述筛选方法包括以下步骤：

32、将待筛选化合物和所述线粒体标记细胞混合，处理6～12小时，测定nanoluc荧光素酶和firefly荧光素酶的活性；

33、以不与待筛选化合物混合的线粒体标记细胞作为对照组；

34、以阳性线粒体自噬激动剂作为阳性对照；

35、同时设置待筛选化合物和阳性线粒体自噬激动剂联合处理组。

36、在本发明一些实施例方式中，所述方法还包括通过与对照组及线粒体自噬激动剂单独处理组进行比较，分析待筛选化合物对线粒体自噬活性的影响，通过下表的标准来判断待筛选化合物是否具有线粒体自噬激动剂或抑制剂的特性。

37、在本发明一些实施方式中，所述处理的时间为6～12小时。

38、在本发明一些实施方式中，在检测nanoluc荧光素酶和firefly荧光素酶的活性时，nanoluc荧光素酶活性用firefly荧光素酶活性进行校正，相对活性等于nanoluc荧光素酶活性与firefly荧光素酶活性的比值。

39、在本发明一些实施方式中，firefly荧光素酶活性作为内参，在阳性线粒体自噬激动剂(如o/a，10μm oligomycin+4μm antimycin a)处理下没有发生显著变化，可以用于校正nanoluc荧光素酶活性，所述相对活性即nanoluc荧光素酶活性与firefly荧光素酶活性的比值来表示atp5b的水平，从而准确反映线粒体自噬活性。

40、在本发明一些实施方式中，当待筛选药物的相对活性较对照组不变或升高，且联合处理组的相对活性较对照组不变时，待筛选药物为线粒体自噬抑制剂；当待筛选药物的相对活性较对照组不变，且联合处理组的相对活性较对照组降低，待筛选药物与线粒体自噬无关；当待筛选药物的相对活性较对照组降低，且联合处理组的相对活性较对照组降低时，待筛选药物为线粒体自噬激动剂(表1)。

41、表1线粒体自噬激动剂或抑制剂筛选标准

42、

43、本发明的有益效果是：

44、本发明提供的线粒体标记细胞具有双荧光素酶报告系统，且该线粒体标记细胞具有常规线粒体的正常功能，如细胞的增殖、atp的产生、基础水平氧化磷酸化功能，基于此双荧光素酶报告系统可用于检测线粒体自噬活性，能真实反映正常生理状态下的线粒体自噬活性，可用于高通量筛选靶向线粒体自噬的化合物，并通过实验证明此方法的可行性。

45、本发明与酶标仪等酶活性检测仪器相结合实现了从化合物库中简便、快速、高效的筛选具有线粒体自噬调控活性的化合物，寻找新型线粒体自噬的激动剂及抑制剂，用于科学研究或指导线粒体自噬失调相关疾病药物的开发。