一种靶向OsSHMT1基因的sgRNA、sgRNA表达载体及其应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种靶向osshmt1基因的sgrna、sgrna表达载体及其应用。

背景技术：

1、化学控草是现代农业的必要措施和重要标志，杂草在除草剂选择压力下进化出抗药性是必然规律和现实危害，全球已有1581例杂草生物型对167种除草剂产生抗药性且呈愈演愈烈之势，任其发展将面临“无药可用”、草害猖獗的困境。

2、植物毒素作为一种针对植物不同过程的新型除草剂，已逐渐被人们所认识(macías et al.,2019)。在几种中链脂肪酸中，如壬酸(ch3(ch2)7co2h)，被鉴定为高效、广谱、发展抗除草剂风险低的植物毒素(coleman and penner,2008；real et al.,2021)。我们最近研究的羊脂酸(c8h16o2,cap)可以通过破坏叶细胞中的叶绿体和线粒体，表现出高的除草活性，从而成为一种有效的杂草除草剂(li et al.2018；li et al.2019b)。在田间试验中，cap表现出比商品化除草剂草铵膦和草甘膦更快的除草活性。羊脂酸可作为主要除草剂的替代品，具有生产简便、安全高效等优点。我们最近研究发现小飞蓬丝氨酸羟甲基转移酶(ccshmt1)是一种潜在的cap除草剂靶点。“高效低风险除草剂+耐除草剂作物”将是解决杂草危害最直接最有效的途径，特别是靶向除草剂创制和基因编辑选育耐除草剂作物。植物源除草剂对农田环境影响小，是治理杂草优选方案。crispr/cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由guiderna介导的dna切割技术，针对cas的不同已经开发出多种编辑系统，包括cas9、cpf1、cms1、c2c1、c2c2等。crispr/cas编辑技术可以实现三种定点编辑：第一种是基因的定点敲除。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用crispr/cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。本发明应用第三种方法对osshmt1基因的第7外显子序列进行碱基编辑，获得耐cap作物。

技术实现思路

1、为了获得抗羊脂酸作物，本发明提供以下技术方案：

2、一种靶向osshmt1基因的sgrna，所述osshmt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna包括如seq id no.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

3、优选地，所示osshmt1基因的氨基酸序列如seq id no.5所示。

4、一种sgrna表达载体，所述sgrna表达载体包含sgrna，所述sgrna包括如seq idno.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

5、一种制备sgrna表达载体的方法，所述方法包含以下步骤：

6、(1)在osshmt1基因的第7外显子区域设计sgrna，所述osshmt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；

7、(2)将得到的sgrna插入表达载体中，得到所述sgrna表达载体。

8、优选地，在步骤(2)中所述表达载体为evoapobec1-sprycas9n、evocda1--sprycas9n和abe8e-sprycas9n。

9、一种培育耐羊脂酸的水稻品种的方法，所述方法包含以下步骤：

10、(1)在osshmt1基因的第7外显子区域设计sgrna；

11、(2)将得到的sgrna插入表达载体中，得到所述sgrna表达载体；

12、(3)将sgrna表达载体通过农杆菌转化水稻愈伤组织，采用含有羊脂酸的培养基进行筛选，得到水稻阳性苗后采用pcr扩增或者分子测序对osshmt1基因的第194、207或209位进行鉴定；所述pcr扩增采用的引物组为以下任一一组：

13、第一对引物组：

14、f:tgtgtgctgatactaagaagatttc seq id no.6，

15、r:aaacgaaatcttcttagtatcagca seq id no.7；

16、第二对引物组：

17、f:tgtgtgctgaaatcttcttagtatc seq id no.8，

18、r:aaacgatactaagaagatttcagca seq id no.9；

19、第三对引物组：

20、f:tgtgtgatactaagaagatttcagc seq id no.10，

21、r:aaacgctgaaatcttcttagtatcaseq id no.11。

22、优选地，在步骤(1)中所述sgrna包括如seq id no.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

23、osshmt1基因在培育抗羊脂酸作物中的应用，所述osshmt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

24、优选地，所述osshmt1基因的氨基酸序列如seq id no.5所示。

25、本发明的有益效果：

26、本发明在osshmt1基因的第7外显子区域设计sgrna，所述osshmt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sgrna包括如seq id no.2-4所示的核苷酸序列中至少一种，对osshmt1基因进行基因编辑，可以显著提高植物对羊脂酸的耐受性。

技术特征：

1.一种靶向osshmt1基因的sgrna，其特征在于，所述osshmt1基因的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述sgrna包括如seq id no.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

2.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所示osshmt1基因的氨基酸序列如seq idno.5所示。

3.一种sgrna表达载体，其特征在于，所述sgrna表达载体包含权利要求1所述的sgrna。

4.一种制备权利要求3所述sgrna表达载体的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中所述表达载体为evoapobec1-sprycas9n、evocda1--sprycas9n和abe8e-sprycas9n。

6.一种培育耐羊脂酸的水稻品种的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中所述sgrna包括如seq idno.2-4所示的核苷酸序列中至少一种。

8.osshmt1基因在培育抗羊脂酸作物中的应用，其特征在于，所述osshmt1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述osshmt1基因的氨基酸序列如seq idno.5所示。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种靶向OsSHMT1基因的sgRNA、sgRNA表达载体及其应用。本发明在OsSHMT1基因的第7外显子区域设计sgRNA，所述OsSHMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA包括如SEQ ID NO.2‑4所示的核苷酸序列中至少一种，对OsSHMT1基因进行基因编辑，可以显著提高植物对羊脂酸的耐受性。

技术研发人员：李祖任,柏连阳,朱健康,王木桂,王应英,韩进财
受保护的技术使用者：湖南省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17