一种适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法

本发明涉及农业生物，具体涉及一种适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法。

背景技术：

1、毕赤酵母是目前应用最广泛的重组蛋白表达宿主之一，超过4000种重组蛋白得以表达；随着合成生物学发展，毕赤酵母亦用作高效合成活性物质的底盘细胞。诱导型启动子可实现重组蛋白表达时序性表达，常用于重组蛋白（尤其是对表达宿主细胞有毒性的重组蛋白）表达和合成生物学中特定基因可调控性表达。毕赤酵母甲醇诱导启动子p aox1以高强度转录和受甲醇严格诱导的优点得以普遍应用，但作为诱导剂的甲醇易燃易爆有毒在生产上存在较大的安全隐患。

2、针对上述弊端，众多研究人员开展了p aox1的改良工作，但并未取得满意结果。诸多文献中报道的其它诱导型启动子因转录强度低、严谨性差的缺点而未得以普遍使用。鼠李糖诱导型启动子p lra3和p lra4严格受鼠李糖诱导，其中p lra3有较高的转录强度，可用于目的基因时序性表达，但作为碳源和诱导剂的鼠李糖因较高价格限制了该启动子的广泛应用。因而，开发价格低廉的、非甲醇诱导和非葡萄糖抑制的诱导型启动子在毕赤酵母中重组蛋白安全高效生产和合成生物学中有重要应用价值。

3、来源于恶臭假单胞菌f1( pseudomonas putidaf1)的阻遏蛋白cymr可以结合在染色体上操纵基因cuo上，导致操纵基因cuo下游的基因不能转录，蛋白不能表达；4-异丙基苯甲酸（cumate）与cymr结合后，cymr从cuo上解离，从而使得操纵基因cuo下游的基因转录和表达。构建基于cumate和cymr/cuo的诱导系统一般是将cuo嵌入组成型启动子序列的特定位置，从而构建含有cuo且具有生物学功能的启动子；在质粒或染色体上搭建由组成型启动子调控阻遏蛋白cymr适度表达的元件。依据这些元件构建的诱导表达系统在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和哺乳细胞中均呈现严谨诱导而得到应用，但在有重要应用价值的酵母细胞中应用未有报道。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统。

2、本技术的另一目的是提供在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法。

3、根据本发明的适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统，包括含操纵基因有cuo且具有启动活性的启动子p gcwcuo1和实现阻遏蛋白cymr适度表达的调控表达元件p gap200/cymr，其中，所述启动子p gcwcuo1的核苷酸序列如seq id no:12所示，所述阻遏蛋白cymr调控表达元件p gap200/cymr的核苷酸序列如seq id no:21所示。

4、根据本发明的在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法，包括以下步骤：

5、将含有操纵基因cuo且具有启动活性的启动子p gcwcuo1与目的蛋白的编码基因连接，使所述启动子p gcwcuo1调控所述目的蛋白的编码基因的表达，其中，所述启动子p gcwcuo1的核苷酸序列如seq id no:12所示；

6、将阻遏蛋白cymr调控表达元件p gap200/cymr、与所述目的蛋白的编码基因连接的所述启动子p gcwcuo1整合至毕赤酵母染色体，其中，所述阻遏蛋白cymr调控表达元件p gap200/cymr的核苷酸序列如seq id no:21所示；

7、向所述重组毕赤酵母细胞的培养基中添加4-异丙基苯甲酸，诱导表达重组目的蛋白。

8、根据本发明的技术方案，涉及到两个功能元件，即调控阻遏蛋白cymr适度表达启动子和含有操纵基因cuo且有转录活性的调控目的基因表达的启动子，这两个元件同时存在于毕赤酵母染色体上时即可实现四-异丙基苯甲酸诱导表达系统。本发明中将这两个元件构建于一个整合型质粒上，当质粒导入毕赤酵母细胞后，这两个元件整合于染色体同一位点（gas1位点）；亦可采用其它措施，使这两个片段先后整合于毕赤酵母染色体上。

9、根据本发明的具体实施方式，本技术的在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法，包括以下步骤：

10、将含操纵基因有cuo且具有启动活性的启动子p gcwcuo1与含目的蛋白的编码基因的质粒连接，再与阻遏蛋白cymr调控表达元件p gap200/cymr连接，获得毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达质粒，其中，所述启动子p gcwcuo1的核苷酸序列如seq id no:12所示，所述阻遏蛋白cymr调控表达元件p gap200/cymr的核苷酸序列如seq id no:21所示；

11、将所述毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达导入毕赤酵母细胞中，获得重组毕赤酵母细胞；

12、向所述重组毕赤酵母细胞的培养基中添加4-异丙基苯甲酸至5 μg/ml~150 μg/ml，诱导表达重组目的蛋白。

13、根据本发明的技术方案，选用强组成型启动子p gcw14，并筛选了含操纵基因有cuo且具有启动活性的启动子p gcwcuo1；同时通过截短强启动子p gap，筛选了可调控阻遏蛋白cymr适度表达的表达元件p gap200/cymr。基于p gcwcuo1和p gap200/ cymr搭建新型毕赤酵母严谨性诱导表达系统。根据本技术的毕赤酵母诱导表达系统在表达重组蛋白时，以廉价的葡萄糖作为碳源和低浓度廉价无毒的4-异丙基苯甲酸作为诱导剂，即可实现重组蛋白尤其是对毕赤酵母细胞有毒性的重组蛋白安全低成本生产。

14、实现重组蛋白高效表达需要使用强组成型启动子，本发明在强组启动子p gcw14的基础上设计了诱导型启动子p gcwcuo1。在无阻遏蛋白cymr存在时，p gcwcuo1可实现下游基因的高效表达；在cymr存在时，cymr结合于p gcwcuo1上操纵基因cuo上，阻碍rna聚合酶转录，从而阻遏下游基因表达。在诱导表达系统中，阻遏蛋白表达水平很大程度上决定了诱导表达的效果；阻遏蛋白表达水平过低，其不能与操纵基因有效结合，导致诱导表达系统呈现较高的渗漏表达；阻遏蛋白表达水平过高时，在添加诱导剂分子后仍有部分阻遏蛋白与操纵基因结合，从而阻遏目的基因表达，导致诱导表达强度不高。本发明中阻遏蛋白cymr调控表达元件p gap200/cymr，其可实现阻遏蛋白cymr适度表达，在无诱导剂时cymr与操纵基因cuo充分结合，表达系统存在较低的渗漏表达；添加诱导剂后，诱导剂可与cymr重组结合，使其从操纵基因cuo上解离，进而实现目的基因高效表达。