一种从培养细胞中一步提取RNA、DNA和蛋白质的方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种从培养细胞中一步提取rna、dna和蛋白质的方法。

背景技术：

1、生命的本质在于运动，主要是核酸(dna和rna)、蛋白质及其之间的相互作用。因此，提取核酸和蛋白质成为破解生命秘密的基础和前提。在后基因组时代，研究人员从培养细胞中高效分离出高纯度和完整性的核酸和蛋白质变得越来越重要。如今，市场上用于分离核酸和蛋白质的各种试剂盒以及从各种材料中分离的不同方法都在实验中进行。然而，它们总是从不同群体的培养细胞中独立提取，这不仅包含太多步骤，耗费大量时间和金钱，而且影响了它们的生产力、纯度和完整性。最重要的是，很难确保不同组培养细胞的细胞数量、细胞生长和代谢状态的一致性，这将不可避免地增加前后实验之间的实验误差。既然在实验过程中无法完全避免错误，研究人员有责任尽可能地缩小错误。考虑到rt-pcr和蛋白质印迹检测之间的基因表达结果不一致，通常在产品鉴定、论文答辩和其他一些场合会遇到，从不同组的培养细胞中提取的rna和蛋白质可能是导致差异的一个关键因素。

2、中国专利cn202310905531.4公开了用于从微量动物或植物组织中同时快速高效提取dna、rna以及蛋白质的裂解液及其提取方法，裂解液由柠檬酸、edta、nacl、表面活性剂、胍盐和rna保护剂组成，其中，表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。该裂解液能够实现从一块组织中同时提取dna、rna以及蛋白质，不仅可以节省宝贵的样本，特别是人体样本，同时由于三者均来源于同一块组织，避免了选取组织部位的不同造成的差异，使得实验结果更准确，且提取的dna、rna以及蛋白质得率均比现有试剂盒的高，完整性较好，纯度较高。但该专利中是从一块组织中同时提取dna、rna以及蛋白质，组织由许多形态相似的细胞及细胞间质所组成，形态相似的细胞之间也有一定的差异，从而影响实验的可重复性。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了提供一种从培养细胞中一步提取rna、dna和蛋白质的方法。本发明通过用rnazol试剂从同一组培养的hepg2细胞中依次分离rna、dna和蛋白质的方案。方法具体步骤如下：首先，将hepg2细胞培养到对数生长期；第二，从同一组的培养细胞中连续分离rna、dna和蛋白质；第三，检测每个产量；最后，验证了各自的纯度和完整性。从开始到质量验证，该程序只需3～4d，非常有效。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、一种从培养细胞中一步提取rna、dna和蛋白质的方法，具体步骤如下：

4、s1、将待提取的细胞培养到对数生长期后得到培养细胞；

5、s2、从同一组的培养细胞中连续分离rna、dna和蛋白质：在同一组的培养细胞中依次加入rnazol试剂和氯仿，解离培养细胞后低温高速离心，得到苯酚-氯仿相、中间相和水相，rna保留在水相中，dna保留在中间相，蛋白质保留在苯酚-氯仿相中，从苯酚-氯仿相、中间相和水相中分别提取rna、dna和蛋白质；

6、s3、从步骤s2中得到的水相中提取rna；

7、s4、在步骤s2中得到的苯酚-氯仿相和中间相的混合物中加入乙醇，离心后得到沉淀和上清液，dna保留在沉淀中，蛋白质保留在上清液中；

8、s5、从沉淀中提取dna，从上清液中提取蛋白质。

9、进一步地，步骤s1中，所述待提取的细胞为动物细胞，例如hepg2细胞。

10、进一步地，步骤s1中，所述培养时间为1～4d，不同细胞达到对数生长期的时间不同，根据不同的细胞系定时培养。

11、进一步地，步骤s1中，所述待提取的细胞培养到对数生长期的具体步骤如下：

12、s1-1、将待提取的细胞转移至培养基中静置培养；

13、s1-2、当待提取的细胞生长到适当汇合度时，分离待提取的细胞，接种至培养板中继续培养不同时间；

14、s1-3、收集培养至不同时间的待提取的细胞，计细胞数，以平均细胞数为y轴，时间为x轴绘制待提取的细胞的生长曲线，确定待提取的细胞的对数生长期；

15、s1-4、根据步骤s1-3中得到的生长曲线将待提取的细胞接种至培养皿中培养至对数生长期，备用。

16、上述更进一步地，步骤s1-1中，所述培养基为补充有10％热灭活胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10mmol/l hepes(ph 7.4)的rpmi 1640。

17、上述更进一步地，步骤s1-1中，静置培养条件：温度为37℃，co2浓度为0.5％。

18、上述更进一步地，步骤s1-2中，所述汇合度为70～80％。

19、上述更进一步地，步骤s1-2中，通过0.25％胰蛋白酶分离待提取的细胞，将分离后的待提取的细胞以104/ml的密度接种到培养板中，并分别在co2培养箱中培养24小时、48小时、72小时和96小时。

20、上述更进一步地，步骤s1-3中，通过血细胞仪对待提取的细胞进行计数。

21、进一步地，步骤s2中，从同一组的培养细胞中连续分离rna、dna和蛋白质的具体步骤如下：

22、s2-1、在步骤s1中得到的处于对数生长期的同一组的培养细胞中加入rnazol试剂，得到细胞裂解物，将细胞裂解物孵育后离心，得到沉淀和上清液；

23、s2-2、将步骤s2-1中得到的上清液转移至试管中，加入氯仿，混匀后孵育，离心得到苯酚-氯仿相、中间相和水相，rna保留在水相中，dna保留在中间相，蛋白质保留在苯酚-氯仿相中。

24、上述更进一步地，步骤s2-1中，所述孵育时间为4～6分钟，孵育温度为室温；

25、所述离心温度为4℃，离心时间为8～12分钟，离心转速为9000～11000×g。

26、上述更进一步地，步骤s2-2中，按体积比，步骤s2中加入的rnazol试剂：氯仿＝1：0.15～0.25；

27、所述孵育时间为2～4分钟，孵育温度为室温；

28、所述离心温度为4℃，离心时间为10～20分钟，离心转速为9000～11000×g。进一步地，步骤s3中，步骤s2中得到的水相转移至试管中，加入异丙醇，混匀后静置，离心得到沉淀和上清液，弃上清液，洗涤沉淀，干燥后孵育，加入水溶解沉淀后得到rna溶液。

29、上述更进一步地，按体积比，步骤s2中加入的rnazol试剂：异丙醇＝1：0.4～0.6；

30、所述静置时间为8～12分钟，静置温度为室温；

31、所述离心温度为4℃，离心时间为8～12分钟，离心转速为9000～11000×g；

32、所述洗涤方法具体为：将75％乙醇加入沉淀中，涡旋混匀后离心弃上清液；

33、所述干燥方法具体为：空气干燥5-10分钟；

34、所述孵育时间为8～12分钟，孵育温度为55-60℃；

35、所述水为不含rnase的水(depc)。

36、进一步地，步骤s4中，在苯酚-氯仿相和中间相的混合物中加入乙醇，倒置混合后静置，离心后得到沉淀和上清液，dna保留在沉淀中，蛋白质保留在上清液中。

37、上述更进一步地，按体积比，苯酚-氯仿相和中间相的混合物：步骤s2中加入的rnazol试剂：乙醇＝1：0.9～1.1：0.2～0.4；

38、所述乙醇的体积分数为100％，

39、所述静置时间为2～4分钟，静置温度为室温；

40、所述离心温度为4℃，离心时间为4～6分钟，离心转速大于1000×g，小于2000×g。

41、进一步地，步骤s5中，从沉淀中提取dna，从上清液中提取蛋白质的具体步骤如下：

42、s5-1、提取dna：

43、将步骤s4中得到的沉淀转移至试管中，多次洗涤沉淀，在沉淀中加入乙醇，放置，均匀混合，离心后干燥，加入naoh溶解沉淀后得到dna溶液；

44、s5-2、提取蛋白质：

45、将步骤s4中得到的上清液转移至试管中，加入异丙醇，静置，离心后得到沉淀和上清液，弃上清液，蛋白质保留在沉淀中，多次洗涤沉淀，在沉淀中加入乙醇，涡旋，放置，均匀混合，再次离心后干燥，加入十二烷基硫酸钠溶解沉淀后得到蛋白质溶液。

46、上述更进一步地，步骤s5-1中，所述洗涤方法具体为：将洗涤溶液0.1m柠檬酸钠-10％乙醇溶液加入沉淀中，将沉淀在室温下储存在洗涤溶液中20～40分钟，均匀混合，离心弃上清液；

47、按体积比，步骤s2中加入的rnazol试剂：0.1m柠檬酸钠-10％乙醇溶液：乙醇＝1：0.2-0.4：1.5-2；

48、所述乙醇的体积分数为75％，所述放置时间为15～25分钟；

49、所述离心温度为4℃，离心时间为4～6分钟，离心转速为1000～3000×g；

50、所述干燥方法具体为：将沉淀在开放管中风干5-15分钟；

51、所述naoh浓度为7～9mm，naoh用量为20～60μl。

52、上述更进一步地，步骤s5-2中，按体积比，步骤s4中得到的上清液：异丙醇：乙醇＝0.7-0.9：1-2：1.5-2.5；

53、所述静置时间为8～12分钟，静置温度为室温；

54、所述离心温度为4℃，离心时间为8～12分钟，离心转速为11000～13000×g；

55、所述洗涤方法具体为：将2～4ml洗涤溶液0.3m盐酸胍-95％乙醇溶液加入沉淀中，将沉淀在室温下储存在洗涤溶液中15～25分钟，均匀混合，离心弃上清液；

56、所述乙醇的体积分数为75％，所述放置时间为15～25分钟；

57、所述再次离心温度为4℃，离心时间为4～6分钟，离心转速为7000～8000×g；

58、所述干燥方法具体为：将沉淀在开放管中风干5-10分钟；

59、所述十二烷基硫酸钠的质量分数为1％，十二烷基硫酸钠用量为40～60μl；

60、所述溶解温度为40～60℃。

61、与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：

62、(1)通过反复实验，本发明建立了一种相对快速的提取方法，可以从同一组培养细胞中连续提取rna、dna和蛋白质，不仅操作简单、投资低廉，而且提高了实验的可重复性、可比性、可信度和一致性。

63、(2)与现有的各种试剂盒和试剂大多基于独立分离相比，rnazol试剂的特点是从同一组细胞中依次分离rna、dna和蛋白质，省时、低成本、高效。该程序的产物可分别用于rt-pcr、pcr和蛋白质印迹等后续分子生物学检验。

64、(3)rnazol试剂是一种现成的试剂，用于从细胞中分离总rna，rnazol试剂是苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液，在细胞裂解和溶解细胞成分的过程中，rnazol试剂保持rna的完整性。

65、(4)本发明在加入rnazol试剂后再加入氯仿试剂，离心将均质溶液分离成水相和有机相，rna仅保留在水相中，水相转移后，通过用异丙醇沉淀回收rna；去除水相后，可以通过顺序沉淀回收样品中的dna和蛋白质；用乙醇沉淀从中间相析出dna，用异丙醇额外沉淀可从有机相分离出蛋白质。