一种诱导人前列腺基质细胞恶性转化培养模型的方法与应用

本发明涉及基础医学实验，具体涉及一种诱导人前列腺基质细胞恶性转化培养模型的方法与应用。

背景技术：

1、砷作为一种非必需有毒类金属元素，其致癌性经过反复研究论证而逐渐得到公认。1973年，国际癌症研究机构(iarc)首次评估了砷及其化合物的可能致癌作用，初步认为“大量暴露于含无机砷的药物，饮用高砷水及职业性接触，可能与皮肤癌高发有关”，并确定砷为一级人类致癌物。砷通过自然来源、农业生产活动(含砷农药、杀虫剂等的生产和使用)和有色金属冶炼生产等途径进入环境，并以无机砷形式广泛分布于自然界中。研究发现，人持续暴露在砷环境中将严重危害人体的肝脏、心脏和皮肤等多种组织和器官的健康，甚至部分组织或器官发生癌变。砷污染引发的健康问题已成为全球关注的重要公共卫生问题，探究砷污染致细胞发生癌变的过程及获得细胞恶性转化模型，为筛选药物和临床治疗提供方法。

2、cn112941027a公开了一种二甲基亚胂酸致人角质形成细胞恶性转化细胞株及其应用，通过用二甲基亚胂酸诱导人角质形成细胞恶性转化细胞株的形成，为临床治疗二甲基亚胂酸致皮肤癌提供致癌机制，及有效早期诊断、治疗方法。

3、前列腺癌是最常见的男性恶性肿瘤之一，故探究前列腺癌的致癌因素和相关的致癌机制对前列腺癌预防具有重要意义。无机砷广泛分布于自然界中，研究无机砷致前列腺癌的机制，对预防、诊断、治疗无机砷诱导的前列腺癌十分重要。

4、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种诱导人前列腺基质细胞恶性转化模型的方法与应用，成功用亚砷酸钠诱导wpmy-1细胞获得人前列腺基质细胞恶性转化模型，克服无机砷致癌动物模型很难成功的困难。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种诱导人前列腺基质细胞恶性转化模型的方法，所述方法包括以下步骤：

3、(1)在37℃和5％co2培养条件下，使用含胎牛血清、青霉素和链霉素的dmem培养基培养永生化人前列腺基质细胞，获得培养后的wpmy-1细胞；

4、(2)取1×106个所述培养后的wpmy-1细胞接种至10cm培养皿中培养18-24小时，向所述培养皿中加含0-2μm亚砷酸钠的dmem培养基后培养72小时，培养29周得到第52代wpmy-1细胞；

5、(3)用免疫印迹、transwell迁移实验和软琼脂克隆形成实验获取所述第52代wpmy-1细胞emt、迁移和锚定生长情况，当所述第52代wpmy-1细胞的emt发生、迁移能力和锚定生长能力增强时，则所述第52代wpmy-1细胞为人前列腺基质细胞恶性转化模型。

6、根据上述技术方案，本发明中的永生化人前列腺基质细胞为普诺赛公司wpmy-1细胞(商品编号为cl-0467，规格型号为1×106cell/t25培养瓶)。本发明方法采用永生化人前列腺基质细胞wpmy-1作诱导对象，原因是临床上的前列腺癌75％发于前列腺外周带，而前列腺外周带由前列腺基质细胞分化形成。与使用前列腺上皮细胞rwpe-1作诱导对象获得的前列腺细胞恶性转化模型相比较，本发明利用wpmy-1作诱导对象，1μm和2μm亚砷酸钠作为诱导浓度(1μm砷浓度为环境相关暴露浓度)，研究所获人前列腺基质细胞恶性转化模型的转变过程为砷致前列腺癌提供准确的致癌机制，为临床治疗砷致前列腺癌提供有效的早期预防、诊断和治疗方法，为前列腺癌研究提供新的细胞恶性转化模型。

7、优选地，上述技术方案中，按质量百分数计，所述dmem培养基中添加3-10％胎牛血清、0.5-1.5％青霉素和0.5-1.5％链霉素。

8、优选地，上述技术方案中，按质量百分数计，所述dmem培养基中添加5％胎牛血清、1％100u/ml青霉素和1％10mg/ml链霉素。

9、优选地，上述技术方案中，所述免疫印迹实验具体步骤为：

10、(1)提取蛋白质：含蛋白酶抑制剂的ripa缓冲液提取所述人前列腺基质细胞恶性转化模型的蛋白质；

11、(2)移至硝酸纤维膜：所述蛋白质经4-20％sds-page梯度胶分离，将所述分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜；

12、(3)一抗孵育：脱脂奶粉封闭30分钟，将所述硝酸纤维膜用一抗室温孵育2小时，所述硝酸纤维膜用pbs清洗5-10分钟，并更换pbs重复清洗3次，得到一抗处理后的硝酸纤维膜；

13、(4)二抗孵育：将所述一抗处理后的硝酸纤维膜用二抗避光孵育1小时，获得二抗处理后的硝酸纤维膜；

14、(5)检测免疫反应：以gapdh作内参，检测所述二抗处理后的硝酸纤维膜免疫反应的蛋白水平。

15、优选地，上述技术方案中，在二抗孵育的步骤中，所述二抗为山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗。

16、优选地，上述技术方案中，软琼脂菌落形成实验的具体步骤包括如下：

17、(1)制备琼脂培养基：在6孔板的底层加入0.5ml浓度为0.5％的琼脂完全培养基，获得琼脂6孔板；

18、(2)接种：所述人前列腺基质细胞恶性转化模型悬浮于dmem培养基中，向所述dmem培养基加入等体积的0.7％琼脂，混匀获得混合液，快速吸取1ml所述混合液接种于所述琼脂6孔板的孔内，每孔共计5000个细胞；

19、(3)培养：将所述琼脂6孔板置于细胞培养箱培养12天，获得软琼脂克隆，其中，在培养过程中每周补充dmem培养基1-2次；

20、(4)观察：使用结晶紫溶液对所述软琼脂菌落染色1小时，获取所述第52代wpmy-1细胞的锚定生长情况。

21、优选地，上述技术方案中，在接种步骤中，所述dmem培养基含有10％fbs。

22、优选地，上述技术方案中，在观察步骤中，所述结晶紫溶液的使用剂量为0.5ml，浓度为0.005％。

23、优选地，上述技术方案中，transwell迁移实验的具体步骤包括：

24、(1)迁移装备准备：在24孔板中添加700μl完全培养基作为趋化剂，并将孔径为8.0μm的transwell小室放置在上面，以避免产生气泡；

25、(2)迁移：将200μl含有1×104个细胞的无血清细胞悬液加入上层室中，在细胞培养箱中培养24小时；

26、(3)固定及染色：使用含有20％乙醇、0.5％结晶紫于常温下将上室固定及染色15分钟；

27、(4)拍照及计数：使用pbs冲洗上室三次，并用棉签轻轻擦去上室内中未迁移细胞，倒置显微镜下拍照并计数，获取所述第52代wpmy-1细胞的迁移情况。

28、本发明还提供了一种人前列腺基质细胞恶性转化模型在筛选与评估治疗无机砷导致前列腺癌的药物中的应用。

29、在前列腺癌病人的治疗中，雄激素剥夺治疗(adt)是目前针对早期前列腺癌的主要治疗方法，又因adt不能彻底治愈前列腺癌，大多数患者会复发并发展成去势抵抗性前列腺癌(crpc)。但crpc属于分期更高的前列腺癌，经二代雄激素受体抑制剂恩杂鲁胺和雄激素合成抑制剂醋酸阿比特龙(abiraterone acetate，aa)等一线治疗药物治疗一段时间后均产生不同程度的耐药性，具体表现为抗癌效果降低，使患者平均生存期仅能延长3-4个月。本发明使用恩杂鲁胺处理亚砷酸钠诱导的人前列腺基质细胞恶性转化模型，结果发现亚砷酸钠诱导的人前列腺基质细胞恶性转化模型出现恩杂鲁胺耐药与前列腺癌分期高阶段出现恩杂鲁胺耐药状况吻合，提示亚砷酸钠诱导的人前列腺基质细胞恶性转化模型可以直接用于筛选与评估治疗高分期阶段的前列腺癌的新药敏感性，打破细胞恶性转化模型要通过裸鼠成瘤实验，并对肿瘤大鼠进行给药实验才能用于筛选、制备和评估抗癌药物的传统方式，为筛选、制备和评估抗癌药物提供更简便、快速的新方法。

30、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

31、(1)利用1μm与2μm亚砷酸钠使细胞形态变形为细长型、类似纺锤状以提高迁移能力的特性，选用wpmy-1细胞作诱导对象，选用1μm与2μm亚砷酸钠作诱导浓度，快速获得人前列腺基质细胞恶性转化模型；

32、(2)wpmy-1细胞经亚砷酸钠持续重复暴露至第52代再实验检测的方式，确保获取的第52代wpmy-1细胞为wpmy-1细胞恶性转化模型；

33、(3)成功用亚砷酸钠诱导wpmy-1细胞获得人前列腺基质细胞恶性转化模型，克服砷致癌动物模型很难成功的困难。