一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体及其在磁珠微流控免疫检测中的应用

本发明属于生物，更具体地，涉及一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体及其在磁珠微流控免疫检测中的应用。

背景技术：

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone,zen)是从玉米中发现的由镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物，主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、窜珠镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌均能产生这种毒素。这类霉菌可在多种谷物与饲料上滋生，特别是在温度中等湿度较高的环境可以导致毒素的大量产生。我国畜牧业深受玉米赤霉烯酮的影响，对我国部分地区饲料进行随机采集，发现饲料中zen检出率高达90％以上，其中超标率在猪饲料中高达40％。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，可长期存在食物链中，食入后可引起动物急性或慢性中毒、损失机体组织，导致动物繁殖机能异常甚至死亡，给畜牧场造成巨大经济损失，严重威胁动物及人类健康。因此，对饲料和食品中玉米赤霉烯酮检测具有重要意义。

2、目前，玉米赤霉烯酮的检测主要集中在仪器检测方法和免疫分析方法。仪器检测方法包括高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法。由于高灵敏度、操作简单、低成本等优势，酶联免疫吸附测定分析方法(elisa)、胶体金免疫分析方法(gica)和时间分辨荧光微球免疫分析方法被广泛应用于玉米赤霉烯酮快速检测。但已报道的上述报道的免疫分析方法均表现为窄的检测范围，无法实现国家最大残留限量浓度范围的广泛检测，这无异于会增加样品前处理的难度和降低方法的准确度。因此，探索一种简单、快速、可实现宽线性范围的免疫分析方法用于玉米赤霉烯酮检测是必要的和紧迫的。

3、微流控芯片免疫分析通过在芯片上加工出微型通道和其它功能单元以实现抗原和抗体的进样、反应、分离和检测等过程，其最终目标是把一种多功能、快速、高效、试样用量少的微型实验装置应用到免疫分析中以建立微全免疫分析系统。在微流控芯片上进行免疫检测，关键技术是抗体在芯片内的包被与固定，即免疫磁珠与微流控技术的融合。近年来，随着免疫磁珠和微流控技术的发展，形成了将功能化磁珠、抗原/抗体特异性识别和液滴微流控芯片有效结合的免疫磁珠-微流控技术一体化检测技术。与广泛使用的传感器相比，基于免疫磁珠-微流控免疫检测方法，具有仅通过磁力驱动的简单操作，同时实现芯片上多通道高通量检测，读取信号方便快捷的优点，有望在其的基础上建立玉米赤霉烯酮的检测方法可以满足简单、快速、宽线性范围的检测需求。

4、但免疫磁珠-微流控技术一体化检测技术仍然依赖于抗原与抗体的特异性结合，目前主要以单克隆抗体和多克隆抗体报道为主，此类抗体在极端条件下的稳定性差，容易失活。而纳米抗体克服了传统多克隆和单克隆抗体结构稳定性差、化学溶剂耐受性差等脆弱性，具有突出环境高适应性，且具有高亲和力、高表达、生产周期短、易大量制备而成本低等特点，其中最典型的是纳米抗体能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶中仍保留着较高的抗原结合能力，这些性质可以使样品前处理过程得到一定简化。因此开发一种稳定性好，灵敏度高、能耐有机溶剂并适用于微流控免疫检测的抗玉米赤霉烯酮纳米抗体具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体及其应用。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

3、本发明提供了一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示。本发明通过制备人工抗原免疫羊驼获得纳米抗体基因文库，后续通过生物淘筛，从羊驼免疫抗体基因文库中筛选得到了一种抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体，并将其命名为纳米抗体nbzel-227。

4、优选地，所述纳米抗体nbzel-227包括4个框架区(fr1、fr2、fr3、fr4)和3个互补决定区(cdr1、cdr2、cdr3)，4个框架区和3个互补决定区的排列顺序依次为fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。

5、优选地，fr1的氨基酸序列如seq id no.3所示，fr2的氨基酸序列如seq id no.4所示，fr3的氨基酸序列如seq id no.5所示，fr4的氨基酸序列如seq id no.6所示；cdr1的氨基酸序列如seq id no.7所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.8所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.9所示。

6、本发明还提供了一种编码所述纳米抗体nbzel-227的基因，其核苷酸序列如seqid no.2所示。

7、本发明还提供了一种重组载体，所述载体中含有编码纳米抗体nbzel-227的基因。

8、本发明还提供了一种重组细胞，所述细胞中含有上述重组载体。

9、由于本发明已给出了纳米抗体nbzel-227的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因序列，本领域技术人员可在此基础上通过已知的重组dna技术得到本技术所述纳米抗体。因此，任何可用于制备本发明所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本发明的保护范围之内。

10、进一步地，本发明对制备所得的纳米抗体nbzel-227进行耐受性分析，发现所述纳米抗体nbzel-227具有良好的热稳定性；优异的有机溶剂耐受性，其在30％的乙腈中，仍保持91％的活性，在50％的甲醇下仍保持80％的活性，而在50％的丙酮中活性提升至156％；优异的耐酸和耐弱碱性，在ph 3.4～9.4范围内，纳米抗体nbzel-227的仍保持75％以上的活性，在实际样品检测的前处理过程中不会受到有机溶剂以及ph的影响，对玉米赤霉烯酮进行免疫检测的结果准确度高、特异性强、灵敏度高。

11、因此，本发明还提供所述纳米抗体在检测玉米赤霉烯酮中的应用。

12、进一步地，本发明还提供所述纳米抗体、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备检测玉米赤霉烯酮产品中的应用。

13、本发明还提供一种检测玉米赤霉烯酮的方法，所述方法为用玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用所述纳米抗体作为检测抗体进行检测。

14、进一步地，所述玉米赤霉烯酮半抗原的结构式如式(i)所示：

15、

16、进一步地，所述包被原的结构式如式(ⅱ)所示：

17、

18、进一步地，所述载体蛋白为刀豆球蛋白a(cona)。

19、具体地，所述包被原被称为zel-a-cona。

20、本发明还提供一种检测玉米赤霉烯酮的开放式液滴阵列微流控芯片，进一步地，所述开放式液滴阵列微流控芯片包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道设有通过微流控通道狭缝依次相连的第一反应腔室、第二反应腔室、第三反应腔室和尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构；所述第一反应腔室用于装载待测样品、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液；所述第二反应腔室用于装载缓冲盐溶液；所述第三反应腔室用于装载荧光探针溶液。

21、进一步地，所述磁珠抗原为上述人工抗原与磁珠偶联物；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的上述抗玉米赤霉烯酮的纳米抗体；所述缓冲盐溶液为pbs溶液；所述荧光探针溶液为amplex red/h2o2。

22、优选地，所述磁珠抗原为玉米赤霉烯酮人工抗原(zel-a-cona)与nhs磁珠偶联物。

23、优选地，所述平行通道为15个。

24、优选地，所述平行通道间距离为5.0mm；连接反应腔室的微流控通道狭缝宽0.5mm。

25、本发明还提供所述开放式液滴阵列微流控芯片在检测玉米赤霉烯酮中的应用。

26、本发明还提供一种用于检测玉米赤霉烯酮的微流控免疫检测试剂盒，所述试剂盒含有上述所述磁珠抗原和上述所述酶标抗体。

27、进一步地，所述试剂盒还包括上述开放式液滴阵列微流控芯片。

28、进一步地，所述试剂盒还包括pbs溶液、amplex red/h2o2液。

29、本发明还提供一种检测玉米赤霉烯酮的微流控免疫检测方法，通过将酶标抗体与磁珠抗原混合，再加入待测溶液，利用直接竞争法，结合凝胶成像，实现对标志物的特异性识别。

30、进一步地，所述方法为：将游离的待检溶液与磁珠抗原、酶标抗体混合在上述开放式液滴阵列微流控芯片的的第一反应腔室中，在磁铁的牵引下，结合了酶标抗体的磁珠抗原与未结合的磁珠抗原依次进入第二、三反应腔室，在第三反应腔室中结合了酶标抗体的磁珠抗原催化h2o2与底物amplex red反应生成荧光物质试卤灵(resorufin)产生信号输出，根据凝胶成像仪(520nm)和image j软件处理荧光信号进行定量检测。经检验，基于nhs磁珠-微流控的免疫检测方法对玉米赤霉烯酮的检测限为0.03ng/ml，线性范围为0.064～1000ng/ml。

31、因此，本发明还提供上述检测方法在分子检测领域的应用，所述分子检测领域包括食品质量安全检测和环境污染监测等。

32、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

33、本发明提供了一种抗玉米赤霉烯酮纳米抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示。所述纳米抗体具有良好的热稳定性，优异的有机溶剂(甲醇、乙腈、丙酮)耐受性及优异的耐酸性，不易受有机溶剂以及ph的影响。进一步地，本发明将所述纳米抗体用于检测玉米赤霉烯酮，其操作简单，耗时短，结果准确度高。本发明进一步提供一种检测玉米赤霉烯酮的nhs磁珠-微流控免疫检测方法，该方法操作简单，快速，结果准确可靠，灵敏度高，对玉米赤霉烯酮的检测限为0.03ng/ml，线性范围为0.064～1000ng/ml，可实现国家标准中最大残留限量浓度范围的广泛检测。