一种重组载体、细胞及其应用

本发明属于生物，具体涉及基因工程获得重组细菌、细胞及其应用。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、k252c是吲哚咔唑类生物碱，最早从放线菌nocardiopsis sp.中分离得到。其具有蛋白激酶c(pkc)和蛋白激酶a(pka)的抑制活性，细胞渗透性、可逆性和atp竞争性，ic50值分别为2.45μm和25.7μm(pereira,e.r.,et al.med.chem.,1996,39,4471-4477)。k252c可诱导人慢性粒细胞白血病癌细胞凋亡。k252c还能抑制β-内酰胺酶(β-lactamase)、苹果酸脱氢酶和糜蛋白酶，其ic50值分别为8μm、8μm和10μm(liu,r.,et al.arch.pharm.res.,2007,30,270-274)。

3、k252d是k252c的n-鼠李糖糖苷，具有抗真菌、抗癌、抗血小板聚集、神经保护活性作用。k252d的很多结构衍生物已进入癌症治疗的临床ii和iii期研究(zhou j,huang h,wang z,et al.natural product research and development,2011,23,415-419)，最早是从nocardiopsis sp.k-290的代谢产物中分离出来，具有强烈的蛋白激酶c抑制作用，半抑制浓度ic50值为337nm，同时，对钙离子/钙调蛋白依赖的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,pde)具有抑制活性，ic50＝46.2μmol/l(tohru y,takao i,mayumi y,et al.journal ofantibiotics,1986,39,1072-1078)。

4、目前k252d的来源皆为放线菌类，该类菌株培养条件苛刻且周期长，不利于高效的获得大量的产物。

技术实现思路

1、

2、本发明提供一种绿色、高效生产k252d的重组载体、细胞及方法。本发明构建了l-色氨酸高产菌株w3110-63的改良菌株w3110-wu，此菌株可以高效表达l-色氨酸并具有整合外源基因的功能；重组载体a，可高效表达k252c；重组载体b可表达dtdp-鼠李糖，并将鼠李糖转移到k252c上生成k252d。本发明提供共转和共培养两种方法大幅度提升k252d的产量。而本发明所利用的大肠杆菌，不仅便于操作、生长周期短、分离方法简易，更重要的是可以通过改造代谢通路来大幅度提高k252d合成的前体物质。

3、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

4、本发明的第一方面，提供一种载体组合物，包括重组载体a和重组载体b；

5、所述重组载体a至少包括表达l-色氨酸氧化酶、铬吡咯酸cpa合成酶、细胞色素p450酶及表达单加氧酶的核苷酸；

6、所述重组载体b至少包括表达dtdp-葡萄糖焦磷酸化酶、dtdp-4,6-脱水酶、dtdp-3,5-差向异构酶、dtdp-4-脱氢还原酶及糖基转移酶的核苷酸。

7、在本发明的具体实施方式中，所述l-色氨酸氧化酶的氨基酸序列如seq id no.23所示；

8、所述铬吡咯酸cpa合成酶的氨基酸序列如seq id no.24所示；

9、所述细胞色素p450酶的氨基酸序列如seq id no.25所示；

10、所述单加氧酶的氨基酸序列如seq id no.26所示；

11、或，

12、所述dtdp-葡萄糖焦磷酸化酶的氨基酸序列如seq id no.27所示；

13、所述dtdp-4,6-脱水酶的氨基酸序列如seq id no.28所示；

14、所述dtdp-3,5-差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.29所示；

15、所述dtdp-4-脱氢还原酶的氨基酸序列如seq id no.30所示；

16、所述糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.31所示。

17、在本发明的具体实施方式中，所述重组载体a还包括表达l-色氨酸氧化酶的启动子和终止子、表达铬吡咯酸cpa合成酶的启动子和终止子、表达细胞色素p450酶的启动子和终止子及表达单加氧酶的启动子和终止子；

18、或，所述重组载体b还包括表达dtdp-葡萄糖焦磷酸化酶的启动子和终止子、表达dtdp-4,6-脱水酶的启动子和终止子、表达dtdp-3,5-差向异构酶的启动子和终止子、表达dtdp-4-脱氢还原酶的启动子和终止子及表达糖基转移酶的启动子和终止子。

19、优选地，所述的启动子为t7启动子，所述的终止子为t7终止子。

20、优选地，所述重组载体a核苷酸序列如seq id no.32和seq id no.34所示；

21、所述重组载体b核苷酸序列如seq id no.33和seq id no.34所示。

22、本发明的第二方面，提供一种重组细胞，包括第一方面所述的载体组合物。

23、在本发明的具体实施方式中，所述重组细胞的出发菌株为大肠杆菌w3110-wu；

24、具体的，所述w3110-wu的制备方法包括：将基因片段w3110 up-cm-t7 rnap-w3110down转化到大肠杆菌w3110-63-red中获得；

25、其中，w3110-63-red为将质粒ptkred转化到大肠杆菌w3110-63中获得。

26、本发明的第三方面，提供第二方面所述的重组细胞在制备k252d中的应用。

27、具体的，以l-色氨酸为初始底物，利用重组细胞生物转化成k252d；其中，所述的生物转化，其路径为：

28、(1)如图1所示，将l-色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸(ipa)；吲哚-3-丙酮酸(ipa)转化为铬吡咯酸(cpa)；铬吡咯酸(cpa)转化为吲哚咔唑中间体；吲哚咔唑中间体转化为k252c。

29、(2)如图2所示，将葡萄糖转化为dtdp-葡萄糖；dtdp-葡萄糖转化为dtdp-4-酮-6-脱氧葡萄糖；dtdp-4-酮-6-脱氧葡萄糖转化为dtdp-4-脱氢鼠李糖；dtdp-4-脱氢鼠李糖转化为dtdp-鼠李糖。

30、(3)如图3所示，将步骤(1)所述的k252c和步骤(2)dtdp-鼠李糖转化为k252d。

31、本发明的第四方面，提供一种制备k252d的方法，所述方法包括诱导表达第二方面所述的重组细胞；

32、或将第一方面中所述的重组质粒a或重组质粒b分别转化到大肠杆菌w3110-wu中，然后在同一培养基中进行诱导表达获得。

33、在本发明的具体实施方式中，所述诱导表达的条件为：异丙基硫代半乳糖苷iptg的终浓度为0.4-0.6mm，诱导时培养物od600为0.6-0.8，诱导时间为20h-26h，摇床条件为：25℃，恒温摇床，200rpm。

34、本发明取得了如下有益效果：

35、(1)本发明通过构建含有重组质粒(重组载体a：k252c质粒系统、重组载体b：dtdp-鼠李糖质粒系统)的重组细胞，成功实现了将l-色氨酸高效且快速的合成k252d。

36、(2)本发明实现了在大肠杆菌体内高效且快速的将l-色氨酸合成k252c，反应步骤与传统方法相比缩短了生产周期，降低了原料成本，同时显著提高了k252c的产量，为生物合成k252d供了新的理论知识和关键技术。