野外便携式核地杖菌LAMP检测试剂盒

本发明涉及一种野外便携式核地杖菌lamp检测试剂盒，属于生物学。

背景技术：

1、核地杖菌（scleromitrula shiraiana）是桑椹菌核病的病原菌之一。桑椹菌核病俗称桑白果病，是一类严重危害桑椹的真菌病害的统称，主要分为桑椹肥大性菌核病、桑椹缩小性菌核病、桑椹小粒性菌核病三种类型，其病原菌已明确的主要有3种，分别为桑实杯盘菌（ciboria shiraiana）、核地杖菌（scleromitrula shiraiana）、肉阜状杯盘菌（ciboria carunculoides）。桑椹菌核病侵染存在潜育期，其病原菌以菌核在土壤中越冬，在第二年的3月桑花开放的时候，菌核在潮湿的土壤中抽生出子囊盘并且子囊盘中形成子囊孢子，而子囊孢子借气流传播，侵染桑花、新芽、嫩枝等，在4-6月桑椹成熟的前夕开始发病。现如今，随着果桑种植面积的扩大，桑椹菌核病的发生日趋严重，而且病势猛烈连年暴发，并遍及了我国诸多的省（市）果桑种植区，成为果桑产业发展的制约因素之一。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，lamp）是日本学者notomi等发明的一种新型的核酸扩增技术，广泛应用于食品安全、人类疾病检测、植物病害防控等多种领域。该技术特点是：针对靶基因上的6个区域设计4条特异引物，利用一种高活性链置换dna聚合酶在60-65℃的恒温条件下进行扩增反应，可在15-60 min内实现109-1010倍的扩增，并且能产生大量的扩增副产物——焦磷酸镁白色沉淀。lamp反应结果判断方法有琼脂糖凝胶电泳、荧光染料法、浊度法、金属离子指示剂法等。羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue，hnb）是一种金属离子指示剂，在反应初始羟基萘酚蓝与反应溶液中的镁离子结合使溶液呈现紫色，随着扩增反应的进行，镁离子与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去镁离子后使反应溶液呈现蓝色（阳性），而未发生扩增反应的溶液仍保持紫色（阴性）。lamp扩增技术具有操作简单、特异性强、不需要热循环设备、检测结果可通过肉眼判断和快速高效检测的特点，十分适合病原菌的快速检测。关于针对核地杖菌的检测，经检索目前国内外只有利用随机扩增片段长度多态性dna（random amplified polymorphismdna，rapd）技术扩增核地杖菌，筛选出扩增特异性条带，利用特征序列扩增区域（sequencecharacterized amplified region，scar）标记建立了核地杖菌的常规 pcr 分子检测系统，虽然该检测方法比一般pcr扩增体系的灵敏度和稳定性高，但是检测步骤较繁琐，检测时间较长，并且检测过程中需要pcr仪等设备支持。因此，如何针对已有的核地杖菌检测存在费时、步骤繁琐、有设备要求等缺点去设计一种野外便携式核地杖菌lamp检测试剂盒成为急需解决的一个难题，因此，发明一种野外便携式核地杖菌lamp检测试剂盒是必要的。

技术实现思路

1、为了克服现有检测核地杖菌的步骤繁琐、pcr检测技术需要热循环设备和不能快速检测的难题，本发明提供了一种野外便携式核地杖菌lamp检测试剂盒，该野外便携式核地杖菌lamp检测试剂盒能够在60 min内，在65℃的任意等温条件下，快速、高效、便捷地检测到核地杖菌，不需要复杂且昂贵的检测设备，能较好地满足对核地杖菌的现场快速检测。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、本发明野外便携式核地杖菌lamp检测试剂盒，由抽气杆1、抽气筒2、储袋轮3、试剂盒体4、反应釜5、破袋腔7、拉袋轮8、储液袋13、穿袋口23、抽气筒凸槽35、吸气管纳腔36、拉袋轮固钩37、破袋腔壁38、破袋刀体39、破袋刀头40、吸气管纳腔轴承42组成，其特征在于，所述的抽气杆1从上到下分为三部分：端片、中杆和橡胶环，端片是位于上端的圆片，为塑料质，呈圆片状，直径为2-3厘米、厚度为1-3毫米；中杆为塑料质，呈圆筒状，圆筒的外直径为1-1.5厘米、长度为5-10厘米，中杆中央为与外界完全隔绝的空心杆，四周壁的厚度为0.5-1毫米，中杆上端固定在端片下表面中央并被端片封堵，下端内腔开口处由圆片封堵，距离下端边缘1-2毫米的侧壁上设置一个深度和宽度均为0.2-0.5毫米的凹槽，橡胶环即设置在此凹槽中；橡胶环为橡胶质，呈圆环状，橡胶环的内直径为9.6-14毫米、外直径为11-16毫米，橡胶环的横截面为长方形，长方形的长度为0.5-1毫米、宽度为0.2-0.5毫米；抽气筒2为塑料质、玻璃质、不锈钢质或铜质，呈圆筒状，圆筒的内直径为1-1.5厘米、长度为5-10厘米、壁的厚度为0.5-1毫米；抽气筒2包括抽气筒凸管32、抽气筒腔33和抽气筒凸34，抽气筒2的内腔为抽气筒腔33，抽气筒2上端开口，抽气筒2开口处侧壁顶缘的两侧对称设置1对翼，翼呈月牙形，外伸长度为1-1.5厘米；抽气筒2的下端有底，底部中央有一个圆孔，抽气筒2底部外表面在圆孔周缘设置一个抽气筒凸管32，抽气筒凸管32呈圆筒状，抽气筒凸管32的上端固定在抽气筒2底部的外表面中央，抽气筒凸管32的下端游离，抽气筒凸管32的空腔与抽气筒腔33相连通，吸气管24是连通抽气筒腔33和反应筒26内腔的管道，为塑料质，穿行于吸气管纳腔36中，吸气管24的上端插入抽气筒凸管32内，吸气管24和抽气筒凸管32之间为可动连接；抽气筒2底部外表面一直径上在抽气筒凸管32和抽气筒2底部边缘之间，对称设置两个抽气筒凸34，每个抽气筒凸34均呈长方体形，抽气筒凸34的长度为1-2毫米、宽度为1-2毫米、高度为1-5毫米，抽气筒凸槽35是拉袋轮8上顶面上的凹槽；试剂盒体4为透明的塑料质，呈圆柱形，试剂盒体4的四周壁和底壁为一个整体，试剂盒体4的顶壁通过卡扣能够牢固地固定在试剂盒体4四周壁的上缘，试剂盒体4的四周壁、底壁和顶壁的厚度均为0.5-1毫米，试剂盒体4是固着抽气杆1、抽气筒2、储袋轮3、拉袋轮8、反应釜5，将储液袋13从穿袋口23穿过后紧绷着连接在储袋轮3和拉袋轮8之间的盒体，中央从上到下依次为抽气杆1、抽气筒2、拉袋轮8和反应釜5，抽气筒2的抽气筒腔33、拉袋轮8的吸气管纳腔36和反应釜5的反应筒26内的空腔相连通，拉袋轮8的周围为破袋腔7，破袋腔壁38上对应拉袋轮固钩37处各设置一个穿袋口23，穿袋口23对应外侧各设置一个储袋轮3，设置后，储袋轮3中央轴、穿袋口23的中间点和拉袋轮固钩37处以一条直线上；破袋腔7是设置在储袋轮3和拉袋轮8之间由破袋腔壁38所围成的空腔，在破袋腔壁38上留有几个穿袋口23，破袋刀体39和破袋刀头40纵向设置在穿袋口23底壁中央；破袋腔壁38为透明的塑料质，厚度为0.5-1毫米；破袋腔壁38呈圆筒形，破袋腔壁38的上口周缘固定在试剂盒体4顶壁内表面、下口周缘固定在试剂盒体4底壁内表面；穿袋口23共8个，设置在破袋腔壁38同一高度的同一个圆上，相邻两个穿袋口23中心点所在半径所呈的夹角为45º；每个穿袋口23均呈长方体形，长方体的长度为5-10毫米、宽度为1-2毫米、深度为0.5-1毫米；破袋刀体39为锰钢质，呈直角三角形，短直角边的长度为0.25-0.5毫米、长直角边的长度为0.5-1毫米，破袋刀体39立在穿袋口23底壁上表面中央，破袋刀体39的长直角边朝外、短直角边通过热合作用嵌在穿袋口23底壁上表面中央，将整个破袋刀体39固定在穿袋口23底壁上表面中央；破袋刀头40是破袋刀体39长直角边制成的具刃边缘，在最上端，刀刃形成一个锋利的刀尖；储液袋13共8个，分别存放金属离子指示剂羟基萘酚蓝2×hnb lsoamp mix、bst dna 聚合酶、正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip、模板dna溶液和ddh2o，每个储液袋13均由牵拉固着孔9、导引带10、密封隔11和储液腔12组成，其中牵拉固着孔9有2个，位于储液袋13的两端，每个牵拉固着孔9呈圆孔状，圆孔的直径为1-5毫米；导引带10有2个，位于储液袋13两端的牵拉固着孔9和密封隔11之间，由储液袋13的壁热合而成；2个导引带10之间的储液袋13被多个密封隔11分隔成一个个密封袋，每个密封袋内的空腔为储液腔12，储液腔12中盛放定量的反应液，储袋轮3共8个，每个储袋轮3的储液袋13中盛放一种反应液，每种反应液在每个储液腔12内的体积分别为12.5 μl 2×hnb lsoamp mix、1.0 μl bst dna 聚合酶、0.25 μl f3、0.25 μlb3、2.0 μl fip、2.0 μl bip、1.0 μl模板dna溶液和6.0 μl ddh2o；所述的f3序列如seq idno:1所示；所述的b3序列如seq id no:2所示；所述的fip序列如seq id no:3所示；所述的bip序列如seq id no:4所示；储袋轮3是将储液袋13缠绕以便多次使用的可绕储袋轮轴19转动的轮子，设置在试剂盒体4周缘内侧的轮槽里，共8个，相邻两个储袋轮3中心点所在半径所呈的夹角为45º；每个储袋轮3均由固板合页14、固板15、穿固钉孔16、储袋轮上顶板17、储袋轮体18、储袋轮轴19、储袋轮固袋凸20、储袋轮轴承21、储袋轮下顶板22组成，固板15为不锈钢质、铜质或铝合金质，呈长方体形，固板15的长度为1-2厘米、宽度为3-5毫米、厚度为0.5-1毫米，一端通过固板合页14固定在试剂盒体4上表面，另一端距离顶缘1-2毫米处设置一个穿固钉孔16；固板合页14的一个侧叶固定在试剂盒体4上表面上，另一个侧叶固定在固板15一端的下表面上；穿固钉孔16呈扁圆形，长度为3-5毫米、宽度为1-2毫米；储袋轮上顶板17呈圆形，厚度为0.5-1毫米，储袋轮上顶板17内表面中央处，设置一个储袋轮轴承21；储袋轮下顶板22是储袋轮体18下方试剂盒体4底壁的板体，呈圆形，厚度为0.5-1毫米；储袋轮轴承21由内圈和外圈以及内外圈之间的钢珠组成，整体通过热合作用嵌在储袋轮上顶板17或储袋轮下顶板22内表面中央处；储袋轮轴19是储袋轮3中央的转轴，为锰钢质，呈圆柱形，储袋轮轴19的上端和下端均插入储袋轮轴承21的内圈中；储袋轮体18两端粗、中部细，中部外面形成凹陷；储袋轮固袋凸20是储袋轮体18中部外表面上的一个凸起，而且凸起的游离端膨大；拉袋轮8两端粗、中部细，中部外面形成凹陷；拉袋轮8包括抽气筒凸槽35、吸气管纳腔36、拉袋轮固钩37、吸气管纳腔轴承42；抽气筒凸槽35是拉袋轮8上顶面上的凹槽，共2个，每个抽气筒凸槽35均呈长方体形，抽气筒凸槽35的长度为1-2毫米、宽度为1-2毫米、深度为1-5毫米；吸气管纳腔36是拉袋轮8中央垂直方向的空腔，呈圆筒形，吸气管24穿行在吸气管纳腔36中，吸气管纳腔36上端凸出拉袋轮8上表面，与抽气筒2底壁抽气筒凸管32外表面的轴承外圈固定在一起，抽气筒凸管32则与轴承内圈固定在一起，同时，吸气管纳腔36下端凸出拉袋轮8下表面，并固定在吸气管纳腔轴承42的外圈上，而吸气管纳腔轴承42的内圈在固定在此处反应筒26顶壁中央的圆筒状凸起上；拉袋轮固钩37是位于拉袋轮8中央外表面上的挂钩，共8个，相邻两个拉袋轮固钩37中心点所在半径所呈的夹角为45º；每个拉袋轮固钩37一端固定在拉袋轮8中央外表面上，另一端朝上弯折呈钩状；反应釜5是在提取待检测样品的dna后，用注射器将提取的dna从加样口41注射进反应筒26中，然后以提取的dna为模板，让汇集到反应筒26中反应液进行lamp扩增，由温浴筒28为反应液提供65℃的恒温水浴温度条件，反应45-60 min后，直接观察lamp反应溶液颜色变化情况，若为蓝色，则为核地杖菌或存在核地杖菌；若为紫色，则非核地杖菌或不存在核地杖菌；反应釜5由集液口6、吸气管24、导液管25、反应筒26、温浴筒固襻27、温浴筒28、加热电阻丝29、加热蓄电池30、温浴筒开关31、加样口41组成；反应筒26呈圆筒状，反应筒26的顶壁、底壁和四周壁为铜质或铝合金质，各个壁的厚度均为0.5-1毫米，反应筒26的顶壁中央设置一个圆筒状凸起，该凸起固定在吸气管纳腔轴承42的内圈上；反应筒26侧壁靠上部1/4处设置8个开口，8个开口的中心点全部处于同一个水平面上，相邻两个开口中心点所在半径所呈的夹角为45º；8个开口外缘与导液管25连接在一起，保证导液管25的内腔与反应筒26的内腔连通在一起；反应筒26侧壁中部相邻两个开口中间位置设置1个加样口41，加样口41是注射器针头插入后，能够将提取的dna注入反应筒26中，或者一次反应后，用注射器吸取反应后的液体，并反复洗涤反应筒263次时插入注射器针头的开口，加样口41呈正方形，正方形的边长为1-5毫米，加样口由一层硅胶薄膜封堵；温浴筒28是内腔设置有反应筒26，在反应筒26外面的温浴筒28中灌注有水，水形成的液面达到反应筒26中间位置以上、距顶缘1/5的位置以下，温浴筒28呈圆桶状，上底开口，四周壁和底壁由锰钢质板制成，锰钢质板的厚度为1-3毫米，锰钢质板外面覆盖一层厚度为1-2毫米的橡胶，温浴筒28由温浴筒固襻27、加热电阻丝29、加热蓄电池30、温浴筒开关31组成，温浴筒固襻27为锰钢质，呈长片形，长片的长度为1-2厘米、宽度为0.5-1厘米、厚度为1-3毫米，一端焊接在温浴筒28顶部边缘，另一端焊接在反应筒26相邻两个导液管25下端开口之间的侧壁外表面上，焊接后，温浴筒固襻27与水平面之间的夹角为45º-60º，温浴筒28和反应筒26之间有缝隙，温浴筒28内的水即从该缝隙灌入；加热电阻丝29的两端连接在加热蓄电池30的正极和负极上，由加热蓄电池30提供电能；加热蓄电池30为可充电锂电池；温浴筒开关31为自动调控开关，由一个温度计控制，温度计是一种煤油温度计，煤油不导电，煤油温度计的下端盛放煤油的球体插入温浴筒28内的水中；集液口6是位于穿袋口23正下方试剂盒体4底壁上的导液管25上端的开口。

4、所述的野外便携式核地杖菌lamp检测试剂盒的lamp检测引物组合物，由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3组成；lamp引物组合物在检测由核地杖菌引起的桑椹菌核病中的应用；反应液体积共25 μl，包括以下各物质：12.5 μl 2×hnblsoamp mix、1.0 μl bst dna 聚合酶、0.25 μl f3、0.25 μl b3、2.0 μl fip、2.0 μl bip、1.0 μl模板dna溶液、6.0 μl ddh2o；检测核地杖菌的lamp检测方法，包括提取待检测样品的dna，以提取的dna为模板，配制反应体系进行lamp扩增，直接观察lamp反应溶液颜色变化情况，若为蓝色，则为核地杖菌或存在核地杖菌；若为紫色，则非核地杖菌或不存在核地杖菌；或者利用扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外下观察检测结果，若存在梯状条带，则证明检测样品为核地杖菌或存在核地杖菌；若无梯状条带，则证明检测样品非核地杖菌或不存在核地杖菌；取1.0 μl提取的样品dna，加入核地杖菌lamp检测试剂盒中配制共25 μl反应体系，进行lamp反应，其反应条件为65℃，45-60 min。

5、本发明的有益效果为：

6、（1）便携、简单、易操作：本发明提供的用于检测核地杖菌的lamp方法，克服了现有检测的步骤繁琐、pcr检测技术需要热循环设备和不能快速检测等问题。本发明在60 min内，在65℃的任意等温条件下，能快速、高效、便捷地检测到核地杖菌，不需要复杂且昂贵的检测设备，能较好地满足对核地杖菌的现场快速检测。

7、（2）恒温扩增：常规pcr扩增需要热循环仪器进行扩增，而本发明提供的用于核地杖菌的lamp检测方法，不需要热循环仪器，只要能够提供稳定的温度条件，比如水浴锅，就可发生lamp反应，极大扩展了lamp扩增方法的使用范围。

8、（3）灵敏度高：将提取的核地杖菌基因组dna稀释成不同浓度作为模板，分别用lamp方法和常规pcr方法进行灵敏度测定，本发明提供的检测核地杖菌的lamp体系灵敏度为100 fg/μl，是常规pcr检测的10倍。

9、（4）本发明为检测桑椹菌核病病原菌之一的核地杖菌提供了新的技术平台，可用于核地杖菌的快速检测，是国内外首次利用lamp技术检测核地杖菌，这种技术方法快速、高效、操作简易，对预测和预防病原菌发生、及时有效防控桑椹菌核病具有重要现实意义。