一种链霉菌生长曲线的测定方法

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种链霉菌生长曲线的测定方法。

背景技术：

1、链霉菌是属于放线菌门的革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、海洋、冰川、冻土、沙漠等各类环境中。链霉菌能够合成结构多样的次级代谢产物，具有良好的生物活性，如抗生素、抗肿瘤以及酶抑制剂等。因此链霉菌是发现新型先导化合物的重要源泉，尤其是抗生素。据统计，有超过60%的抗生素是由链霉菌产生的。因此对链霉菌的研究至关重要，能够为人类医学、动物健康和农业生产提供丰富的、至关重要的研究材料和产品实体。

2、链霉菌具有鲜明的生理生化特征，它们为好氧细菌，易形成广泛分枝的基内菌丝且菌丝一般不碎裂，在摇床液体培养过程中容易形成菌丝球（如图1所示），而呈不均匀分布。基于原核生物标准命名名录（list of prokaryotic names with standing innomenclature, lpsn , https://lpsn.dsmz.de/family/streptomycetaceae)统计，链霉菌科有效发表并正确命名的物种数为732个（数据截至2023年2月）。

3、种类众多的链霉菌生长状态、生长时间、能够产生的次级代谢产物种类及其合成时间都不尽相同，因此，为了能够优化各类链霉菌次级代谢的发酵条件，必须对链霉菌的生长曲线进行测定。然而由于链霉菌独特的生理生化特质致使其不能用单细胞细菌的测od值的方法绘制生长曲线。目前常用的链霉菌生长曲线测定方法为测细胞干重，但该测定方法耗时较多，且对于使用复杂成分培养基培养的链霉菌（如ms培养基），离心或过滤收集菌体时会受到培养基成分的影响，并不能反应真实的链霉菌生长情况（如图2所示）。随着链霉菌生长，培养基成分减少而菌体量增多可能导致称重结果在整个生长周期变化不规律，测定结果不够准确。

4、因此，亟需改进对链霉菌生长曲线的测定方法，创造更快捷、高效、准确的方法，以求能够帮助优化链霉菌的发酵工艺。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、高效、准确的链霉菌生长曲线的测定方法。

2、为解决上述问题，本发明所述的一种链霉菌生长曲线的测定方法，包括以下步骤：

3、⑴链霉菌活化培养：

4、将保藏于-80℃冰箱中的链霉菌涂布在ms固体平板培养基上，并在28℃培养箱中培养7天，即得平板菌种；

5、⑵链霉菌液体培养及时间梯度取样：

6、在生长良好的平板菌种上取1cm2的孢子接种于装液量为10%的高氏一号液体培养基中，在28℃、160rpm的条件下培养；接种后每12h取一次样品，均匀分散菌丝体后使用去除尖端的1ml移液器吸头吸取菌液1ml，每个时间梯度取样设置三个平行；

7、⑶配制ttc溶液：

8、称取2,3,5-氯化三苯基四氮唑（ttc）粉末0.1g，放置在避光的离心管中，加入10ml浓度为10mg/ml的常温保存的pbs溶解，过滤除菌后每200μl ttc溶液分装在1.5ml的离心管中；

9、⑷链霉菌与ttc反应：

10、将ttc溶液以1%比例加入到步骤⑵取出的不同时间段样品中，室温避光反应30min，此时ttc反应后反应液中生成红色沉淀三苯基甲臢（ttf）；

11、⑸吸光度测定：

12、将反应液离心、去除上清并收集沉淀；随后向该沉淀中加入500μl二甲基亚砜（dmso）溶液，室温避光溶解30min，形成红色溶液，该红色溶液离心后取上清液各200μl，加入96孔板中，以dmso溶液作为空白对照，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度；

13、⑹生长曲线绘制：

14、每个时间段样品的吸光度设置三个平行，使用average函数求平均值，使用stdevp函数计算标准误差；然后以测定时间为x轴，以490nm处的吸光值为y轴，绘制散点图，对散点图进行非线性拟合，绘制生长曲线并得到拟合方程。

15、所述步骤⑴中ms固体平板培养基按下述方法制得：在黄豆饼粉20g中加入800ml自来水煮沸2h，晾凉后过滤除去残渣，加入甘露醇20g、琼脂20g，加自来水补足1l，121℃灭菌20min即得。

16、所述步骤⑵中高氏一号液体培养基按下述方法制得：可溶性淀粉20g先用10ml自来水混匀后，倒入800ml煮开的沸水直至淀粉完全糊化呈半透明状，再加入硝酸钾1g、氯化钠0.5g、无水硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸亚铁0.01g，加自来水补足1l，121℃灭菌20min即得。

17、本发明与现有技术相比具有以下优点：

18、1、本发明利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（ttc）与活细胞呼吸作用产生不溶性的红色稳定的三苯基甲臢（ttf）的原理，进而用二甲基亚砜（dmso）能溶解细胞中的ttf，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映链霉菌活细胞数量，以测定时间为x轴，以490nm处的吸光度为y轴，绘制链霉菌生长曲线。

19、2、本发明首次利用ttc法实现了链霉菌生长曲线的快速、准确测定，避免了复杂培养基成分对生长曲线测定过程中带来的误差，同时根据链霉菌呼吸作用的强弱表示生长曲线的方法能够为链霉菌次级代谢产物的发酵工艺优化提供数据支持。

技术特征：

1.一种链霉菌生长曲线的测定方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种链霉菌生长曲线的测定方法，其特征在于：所述步骤⑴中ms固体平板培养基按下述方法制得：在黄豆饼粉20g中加入800ml自来水煮沸2h，晾凉后过滤除去残渣，加入甘露醇20g、琼脂20g，加自来水补足1l，121℃灭菌20min即得。

3.如权利要求1所述的一种链霉菌生长曲线的测定方法，其特征在于：所述步骤⑵中高氏一号液体培养基按下述方法制得：可溶性淀粉20g先用10ml自来水混匀后，倒入800ml煮开的沸水直至淀粉完全糊化呈半透明状，再加入硝酸钾1g、氯化钠0.5g、无水硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸亚铁0.01g，加自来水补足1l，121℃灭菌20min即得。

技术总结
本发明涉及一种链霉菌生长曲线的测定方法，该方法包括以下步骤：⑴链霉菌活化培养；⑵链霉菌液体培养及时间梯度取样；⑶配制TTC溶液；⑷链霉菌与TTC反应，反应液中生成红色沉淀三苯基甲臢；⑸吸光度测定：将反应液离心、去除上清并收集沉淀；随后向该沉淀中加入二甲基亚砜溶液，室温避光溶解30min，形成红色溶液，该红色溶液离心后取上清液加入96孔板中，以DMSO溶液作为空白对照，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度；⑹生长曲线绘制：使用AVERAGE函数求平均值，使用STDEVP函数计算标准误差；然后以测定时间为X轴，以490nm处的吸光值为Y轴，绘制散点图，对散点图进行非线性拟合，绘制生长曲线并得到拟合方程。本发明快速、高效、准确。

技术研发人员：吴玉洁,张威,刘光琇,陈拓,牛小敏,于雪
受保护的技术使用者：中国科学院西北生态环境资源研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15