一种抗PD-L1蛋白的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种抗pd-l1蛋白的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、1993年，hamers的研究报告中提到，在羊驼科动物体内首次发现了一种特殊的抗体，被称为重链抗体或vhh抗体。这些抗体缺失了常见的轻链，在抗原结合方面仅依赖于重链的可变区域（vhhs）。vhh抗体是迄今为止功能最小完整的抗体分子片段，由4个框架区域（fr1～fr4）和3个互补决定区域（cdr1～cdr3）构成。其相对分子质量约为15k da，仅为常规抗体的十分之一。这种抗体分子高度为4.8 nm，直径约为2.2 nm，因此被称为纳米抗体（nanobody）。纳米抗体具备许多优点，如分子量小、物理稳定性高、易于表达等。此外，纳米抗体不容易聚集沉淀，并且仍然保持与抗原结合的能力。

2、pd-1（程序性死亡分子1）是一种免疫抑制性受体，属于cd28超家族的t细胞调节受体。pd-1基因位于2q37.3染色体，编码一种含有288个氨基酸的跨膜蛋白。它的结构包括胞外区、跨膜区和胞质区，其中胞外区具有一个重要的igv样结构域和4个n连接糖基化位点。pd-1在氨基酸序列上与cd28、ctla-4和诱导型t细胞共刺激因子存在差异，因此与配体的结合非常特异。pd-1的表达广泛分布在t淋巴细胞、自然杀伤细胞、b淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞等免疫细胞中。特别是在肿瘤特异性t细胞上表达较高。pd-1的转录受多种转录因子的调节，如nfat、notch、foxm1和irf9等。pd-1的过度表达在肿瘤、慢性感染和其他免疫相关疾病中起到免疫抑制的作用。

3、pd-l1（程序性死亡配体1）和pd-l2（程序性死亡配体2）是pd-1的两个配体，其中pd-l1是主要配体，由pd-l1基因编码。pd-l1的全长由7个外显子编码，是一种1型跨膜蛋白。pd-l1的表达可以是构成性的或诱导性的。构成性的pd-l1低水平表达在静息淋巴细胞、抗原递呈细胞和某些组织中存在，并有助于维持组织的稳态。在炎症或感染的情况下，pd-l1可以被诱导表达在造血细胞、内皮细胞和上皮细胞等免疫细胞上。pd-l1的表达受多种因素影响，如tlr和ifn-γ等信号通路。pd-l1的过度表达在肿瘤中起到逃避免疫应答的作用。pd-l1通过与其受体结合并激活增生性和存活信号通路，在癌细胞中具有促肿瘤发生的作用。

4、肿瘤细胞表面的pd-l1与t细胞表面的pd-1受体结合后，可抑制t细胞的活性，使阻滞在g0/g1期，从而抑制t细胞的增殖，并诱导t细胞的凋亡，从而造成肿瘤免疫逃逸。pd-1/pd-l1抑制剂可阻断pd-1和pd-l1的结合，使t细胞恢复活性，实现对肿瘤细胞的免疫抑制。虽然pd-1/pd-l1抑制剂已在临床上用于治疗多种肿瘤，但仍面临着有效率低、引发自身免疫性疾病等问题。

5、近年来，越来越多的研究发现多种肿瘤病人的血浆中存在着高浓度的和可溶性pd-l1，并且可以发挥与细胞膜表面pd-l1同样的免疫抑制功能，这可能是pd-1/pd-l1疗法反应率低的一个原因。免疫细胞暴露于不含pd-l1的肿瘤细胞后可被重新激活，并可行进至远处攻击可分泌pd-l1的肿瘤细胞，还会诱导t细胞产生强大的记忆反应，抑制可分泌pd-l1肿瘤细胞的生长。

6、cn115433281a公开了抗pd-l1的人源化纳米抗体，结果显示：纳米抗体nb43，m2，m5和m7亲和力分别为6.772nm，2.667nm，1.047nm和19.84nm。

7、开发一种抗pd-l1白的纳米抗体具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种pd-l1蛋白的纳米抗体及其应用。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供：

4、一种抗pd-l1蛋白的纳米抗体，包括框架区域和互补决定区域，其互补决定区域cdr1～cdr3的氨基酸序列为cdr1：gytisrns、cdr2：iensdst、cdr3：aapkvgqfsdialghlafmtlpalny。

5、在一些纳米抗体的实例中，其框架区域fr1～fr4的氨基酸序列如下：

6、fr1：vqlvesgggqvqaaggslklscqas、fr2：mgwfrqapgkqregvva、fr3：tyadsvkgrftislgnaakntlylemnslkpedtamyc、fr4：wgqgtqvtvss。

7、在一些纳米抗体的实例中，其氨基酸序列为：

8、mdqvqlvesgggqvqaaggslklscqasgytisrnsmgwfrqapgkqregvvaiensdsttyadsvkgrftislgnaakntlylemnslkpedtamycaapkvgqfsdialghlafmtlpalnywgqgtqvtvsshhhhhh。

9、本发明的第二个方面，提供：

10、一种基因，其编码本发明第一个方面所述的纳米抗体。

11、在一些基因的实例中，根据表达体系的不同进行密码子优化。

12、在一些基因的实例中，其核苷酸序列为：

13、ccatggatcaggtgcagctggtggaaagcggcggcggccaggtgcaggcggcgggcggcagcctgaaactgagctgccaggcgagcggctataccattagccgcaacagcatgggctggtttcgccaggcgccgggcaaacagcgcgaaggcgtggtggcgattgaaaacagcgatagcaccacctatgcggatagcgtgaaaggccgctttaccattagcctgggcaacgcggcgaaaaacaccctgtatctggaaatgaacagcctgaaaccggaagataccgcgatgtattgcgcggcgccgaaagtgggccagtttagcgatattgcgctgggccatctggcgtttatgaccctgccggcgctgaactattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagccaccaccaccaccaccactgactcgag。

14、本发明的第三个方面，提供：

15、一种表达体系，插入有本发明第二个方面所述的基因。

16、在一些表达体系的实例中，其为原核表达体系或真核表达体系。

17、在一些表达体系的实例中，原核表达体系为大肠杆菌。

18、在一些表达体系的实例中，真核表达体系为cho细胞。

19、本发明的第四个方面，提供：

20、本发明第一个方面所述纳米抗体在制备pd-1配体免疫吸附剂中的应用。

21、在一些应用的实例中，所述pd-1配体包括但不限于pd-l1分子。

22、在一些应用的实例中，所述免疫吸附剂用于治疗由可溶性的pd-1配体引起的肿瘤抑制作用。

23、在一些应用的实例中，所述肿瘤包括但不限于透明细胞肾细胞癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺导管腺癌和胶质母细胞瘤等。

24、本发明的第五个方面，提供：

25、一种免疫吸附剂，包括固相载体，所述固相载体上偶联有本发明第一个方面所述的纳米抗体。

26、在一些免疫吸附剂的实例中，所述固相载体选自壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂、纤维素中的至少一种。

27、在一些免疫吸附剂的实例中，所述固相载体上还偶联有其他免疫吸附蛋白。

28、在一些免疫吸附剂的实例中，采用nhs活化法进行偶联。

29、在一些免疫吸附剂的实例中，所述偶联的步骤如下：

30、1) 纳米抗体溶液用ph=8 .0～8 .5含0 .1m nahco3和0 .5m nacl的偶联液b缓冲溶液进行透析2 h；

31、2) 取nhs预活化的填料用预冷的1mm hcl偶联溶液a进行冲洗，冲洗完成后加入0.5倍填料体积的偶联溶液a，然后再加入1 .5倍填料体积的纳米抗体溶液，振荡孵育后加入2倍填料体积的封端液（0 .1m tris-hcl，ph=8 .3）振荡封端，然后抽干；

32、3) 往抽干后的填料中加入ph=8～9的0 .1m tris-hcl与ph=3～6的0 .2m醋酸交替洗涤，然后加入pbs溶液清洗填料，抽干，保存于20%乙醇中。

33、本发明的第六个方面，提供：

34、一种血液净化器械，其包括本发明第五个方面所述的免疫吸附剂。

35、本发明的第七个方面，提供：

36、一种pd-l1蛋白检测试剂，包括本发明第一个方面所述的纳米抗体。

37、本发明的有益效果是：

38、本发明一些实例的抗pd-l1蛋白的纳米抗体，对游离的可溶性pd-l1分子具有良好的结合力，可用于吸附去除肿瘤患者血液中游离的可溶性pd-l1分子。因抗原抗体的结合力更强，所以相较于受体pd-1合成的免疫吸附剂，其对特定的pd-l1蛋白的清除效率更高，为癌症的免疫治疗提供了新的治疗方式。同时也可以用于pd-l1蛋白的检测。

39、本发明一些实例的免疫吸附剂和血液净化器械，可以通过血液净化的方式同时清除肿瘤患者血清中游离的可溶性pd-l1分子，提高清除率，减少免疫逃逸作用，增强nk细胞的靶向杀伤作用。