基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法

本发明属于转基因，具体涉及基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法。

背景技术：

1、随着人类社会的发展和科技的进步，转基因技术成为了现代农业领域的重要研究方向之一，转基因玉米自1996年商业化以来，其在全球范围得到了广泛种植和应用，商业化23年来累计种植面积7.5亿公顷，玉米转基因技术的出现，为人类提供了更加有效的农业生产手段。

2、因此目前多用外源基因检测即核酸水平检测，常用的核酸水平检测方法有三种：常规pcr、荧光定量pcr技术、下一代测序技术，常规pcr灵敏度偏低；荧光定量pcr技术是目前转基因测定的金标方法，此方法与下一代测序技术都依赖高端设备和技术人员，不适用现场检测和基层组织的检测；下一代测序技术多用于大米和大豆转基因检测中，对于多倍体作物，如玉米、马铃薯和小麦等的检测仍有难度，且噪音较大，影响方法的灵敏度，因此，现有的快速检测玉米转bar基因方法均依赖于大型仪器且检测时间较长，结果鉴定复杂，不能实现可视化的检测。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法，以解决上述背景技术中提出的现有的快速检测玉米转bar基因方法均依赖于大型仪器且检测时间较长，结果鉴定复杂，不能实现可视化的检测的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法，具体检测方法步骤如下：

3、步骤一：选取试验设备和转基因检测原料及辅料，检验人员对原材料进行检验，并且对试验设备及转基因检测设备进行试运行，并且向工作人员进行技术交底工作；

4、步骤二：在bar基因的序列(由genbank查询获得)两端加入pstⅰ和fseⅰ的酶切位点；将ptraux质粒进行双酶切反应；

5、步骤三：在无菌区，向lb平板表面打入150μl的e.coli bl21(de3)冻存菌，在37℃条件下，过夜培养，在5ml lb液体培养基中，接种培养完成的单菌落，放入事先设置好的培养箱中，振荡培养一夜，至od600值达到0.4；

6、步骤四：在步骤三的基础上将含有1ml菌液、45ml的lb培养基的锥形瓶放置其中培养3h，od600值为0.4时，取出放入冰水中，用冰水混合物冰浴菌液30min，菌液放入事先调好的离心机中，离心15min，留下沉淀；

7、步骤五：再步骤四产物中取预冷的0.1mol/l cacl2溶液，吹散菌体，并迅速浸于冰面下，放置30min，将离心管放入离心机，离心12min，留取沉淀，再用2ml预冷的0.1mol/lcacl2溶液，吹散沉淀，取200μl菌液与200μl已灭菌的40％甘油，混匀后，保存于零下80℃冰箱；

8、步骤六：在步骤五制备的两管感受态细胞浸于冰水中，放置6min，并分为a、b两管，a管加入8μl连接产物，b管中加入8μl ddh2o做阴性对照，混匀冰中放30min，将样本于42℃水浴锅中，精准的热激90sec，然后快速放回冰水中，放置5min；

9、步骤七：在步骤六的基础中将800μl lb培养基加入每管，轻轻混匀，将样本放入设置好的培养箱中，培养45min，将其放入事先调好的离心机中，离心5min，保留100μl上清液，吹散沉淀，将其转移到lb平板(含100ng/μl终浓度的壮观霉素)上，均匀涂满整表面，正向放置于37℃培养箱中，培养30min，然后倒置培养过夜，筛选阳性质粒；

10、步骤八：通过改良ctab法进行基因组的提取并且进行lamp引物的设计与筛选，最终进行lamp反应体系的优化、lamp灵敏度的验证、lamp特异性的验证和lamp实际样本验证。

11、进一步的；所述步骤二中双酶切反应按照以按照以20μl反应体系：pstⅰ试剂1μl，fse试剂1μl，10×buffer 2μl，浓度为600ng/μl的template 1μl，灭菌水15μl，加入试剂于30℃下保温1h，进行双酶切反应(20μl)，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，进行凝胶回收。

12、进一步的；所述步骤一中检验人员对转基因试验材料和试验设备进行生产许可证检测，企业采购进口需法定检验的材料，应当向供货者索取有效的检验合格证明，材料相关指标必须自检合格后方可入库。

13、进一步的；所述步骤八中在真菌粉末中加入预热的2％ ctab裂解液800μl、20μl蛋白酶k溶液，混匀，55℃水浴锅中保温50min，每10min震荡混匀一次，12000rpm离心10min，取上清加入等体积酚-氯仿-异戊醇，混匀，在4℃冰箱放置7min，将以相同的条件进行离心，取上清，用2倍体积预冷的无水乙醇混匀，在4℃冰箱静置40min，以相同条件离心，保留沉淀，用350μl的70％乙醇，漂洗3次，用吸水纸充分除去残留的试剂，用25μl预冷的te溶液，充分溶解沉淀，加入1μl rnase，于37℃条件下，孵育30min。

14、进一步的；所述步骤三中将离心机设置为4℃、4500rpm，恒温震荡培养箱设置为37℃、190rpm。

15、进一步的；所述步骤五中将离心机设为4500rpm，水浴锅设为42℃，培养箱设为110rpm、37℃。

16、进一步的；所述步骤八中以20μl可视化反应lamp体系：10×lamp primer mix(10μmol/l)2μl，2×bst 4.0primer mix 10μl，ddh2o 7μl，模板1μl以及25μl的荧光实时lamp反应体系：10×lamp primer mix试剂2.5μl，染料0.5μl，ddh2o 21μl，模板1μl中以阳性标准品为模板，进行引物筛选。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、(1)选取试验设备和转基因检测原料及辅料，检验人员对原材料进行检验，并且对试验设备及转基因检测设备进行试运行，并且向工作人员进行技术交底工作，使基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法在测试中井然有序，减小容错率，提高检测精度，通过恒温扩增技术，摆脱了对大型设备和专业人员的依赖，已广泛应用于转基因农产品的相关检测工作中。

19、(2)环介导等温扩增技术能够在60～65℃恒温条件下，使用4～6条特异性引物集，在链置换dna聚合酶的作用下实现核酸快速高效特异的扩增，可以在15-60分钟内实现快速扩增，这种扩增效率高，使得lamp在转基因检测中具有较高的特异性和灵敏性，仅需要水浴锅就可以实现，操作更为简便，更适用于基层实验室或养殖单位进行早期筛查诊断。

20、(3)该基于实时环介导等温扩增技术快速检测玉米转bar基因方法，本实验尝试将lamp技术应用到转基因的检测中，根据其扩增产物与钙黄绿素结合可释放黄绿素发出黄绿色荧光，可以通过观察颜色反应来判断lamp扩增结果是否为阳性，结果鉴定简单直观，实现了可视化的检测，并借助荧光定量pcr技术实现对lamp的实时鉴定，为转基因玉米的可视化检测提供技术支撑，整体的工艺步骤简单，便于操作，实用性强，适合广泛推广使用。