一种循环肿瘤细胞阴性富集方法

本发明涉及分子生物学，具体涉及一种循环肿瘤细胞阴性富集方法。

背景技术：

1、癌症是严重威胁全球生命健康的主要疾病之一。良性肿瘤与恶性肿瘤最重要的区别之一在于后者具有较强的转移侵袭能力，可向远端器官转移，而这往往是导致患者死亡的最终原因。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,ctcs)是指从恶性肿瘤组织中脱落，进入外周血循环并向远端转移的肿瘤细胞。研究表明，循环中里路细胞可用于癌症的早期筛查、临床诊断、术后预测、动态检测以及指导用药。

2、然而由于循环肿瘤细胞的稀有性和异质性，分离和富集循环肿瘤细胞面临着严峻的挑战。经过几十年的研究与探索，目前循环肿瘤细胞的富集方法众多，但从分离原理上主要分为基于免疫亲和和基于生物物理特性如细胞大小、密度等的两大类分离策略，从分离技术上主要分为免疫磁珠和微流控芯片两大类。其中基于上皮细胞黏附分子(epcam)免疫磁珠阳性富集循环肿瘤细胞的cellsearch系统已被fda批准用于乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的临床研究。然而依赖于癌细胞表面的epcam检测循环肿瘤细胞的方法，因为循环肿瘤细胞的异质性和emt的发生导致细胞表面epcam表达缺失或下调，使得循环肿瘤细胞的捕获率受到影响。尽管使用高特异性和亲和力的核酸适配体、多肽来提高捕获效率，但生物活性分子容易降解和失活导致临床检测应用受限。

3、基于这些局限性，目前报道了一些改善方法，例如针对循环肿瘤细胞发生emt后导致间质型循环肿瘤细胞被epcam抗体磁珠无法捕获的问题，引入间质型标志物n-钙黏蛋白等或使用双抗体修饰的磁珠分离循环肿瘤细胞。还可以利用生物酸例如单宁酸修饰在纳米磁珠表面，通过酚羟基与癌细胞表面的糖萼强作用力与循环肿瘤细胞结合。同时单宁酸还显示出良好的抗白细胞粘附作用，可减少与非靶细胞的相互作用。

4、综上所述，现经报道的多种循环肿瘤细胞分离方法虽然各自具有独特的检测优势，但是依旧存在一些问题，如分离技术复杂、操作繁琐、细胞活性低等。因此，需要开发一种操作简便且高效的光谱循环肿瘤细胞分离方法。

技术实现思路

1、为解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，提高了循环肿瘤细胞的捕获效率。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，包括如下步骤：

4、s1.将肿瘤患者血样进行密度梯度离心，去除红细胞和血浆；

5、s2.加入结合有cd45抗体和cd66b抗体的磁珠进行孵育，通过磁力去除白细胞，阴性富集循环肿瘤细胞。

6、进一步，还包括步骤：

7、s3.利用多色免疫荧光技术对循环肿瘤细胞进行标记，并基于扫描采集的荧光信号，通过细胞染色荧光强度和形态来鉴定循环肿瘤细胞。

8、进一步，步骤s1具体为：将淋巴细胞分离液和肿瘤患者血样在pbmc离心管混合，进行第一次离心，将单核细胞层转移至第一离心管，加入缓冲液洗涤，进行第二次离心，加入缓冲液重悬细胞，转移至第二离心管中。

9、进一步，步骤s1中所述淋巴细胞分离液与肿瘤患者血样的体积比为3～5：1，第一次离心的条件为：20℃，500～800g，20～30min，第二次离心的条件为：20℃、200～300g、8～15min。

10、进一步，步骤s2具体为：将分别结合有cd45抗体和cd66b抗体的磁珠加入所述第二离心管中，混匀并在旋转仪上孵育，然后置于磁力架上孵育，将上清液全部转移至第三离心管中，向第二离心管中再次加入缓冲液轻轻吹打，并置于磁力架上孵育，将上清液全部转移至第三离心管中，将所述第三离心管进行离心，弃上清，得到阴性富集的循环肿瘤细胞。

11、进一步，步骤s2中，加入磁珠后在旋转仪上孵育的时间为20～30min，在磁力架上孵育的时间为10～20min。

12、进一步，步骤s2中第三次离心的条件为：20℃、180～200g、5～10min。

13、优选的，步骤s2中向第三离心管离心后的沉淀中加入缓冲液重悬细胞，沉降于载玻片上。

14、进一步，步骤s2中向第三离心管离心后的沉淀中加入缓冲液重悬细胞，沉降于载玻片上。

15、进一步，步骤s3中所述多色免疫荧光技术所用的染料为fitc-ck、apc-cd45和dapi。

16、本发明的有益效果是：本发明的循环肿瘤细胞阴性富集方法先通过密度梯度离心去除血样中的红细胞和血浆，然后通过结合有cd45和cd66b的磁珠去除白细胞和中性粒细胞，并通过对抗体与磁珠的混合方式、孵育顺序进行优化，使得血样捕获背景中的白细胞的清除率达90％以上，中性粒细胞的清除率在75％以上，具有较好的灵敏度，可以在数量较少的样本中稳定的检测出循环肿瘤细胞。

技术特征：

1.一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，还包括步骤：

3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，步骤s1具体为：将淋巴细胞分离液和肿瘤患者血样在pbmc离心管混合，进行第一次离心，将单核细胞层转移至第一离心管，加入缓冲液洗涤，进行第二次离心，加入缓冲液重悬细胞，转移至第二离心管中。

4.根据权利要求3所述的循环肿瘤阴性富集方法，其特征在于，步骤s1中所述淋巴细胞分离液与肿瘤患者血样的体积比为3～5：1，第一次离心的条件为：20℃，500～800g，20～30min，第二次离心的条件为：20℃、200～300g、8～15min。

5.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，步骤s2具体为：将分别结合有cd45抗体和cd66b抗体的磁珠加入所述第二离心管中，混匀并在旋转仪上孵育，然后置于磁力架上孵育，将上清液全部转移至第三离心管中，向第二离心管中再次加入缓冲液轻轻吹打，并置于磁力架上孵育，将上清液全部转移至第三离心管中，将所述第三离心管进行离心，弃上清，得到阴性富集的循环肿瘤细胞。

6.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，步骤s2中，加入磁珠后在旋转仪上孵育的时间为20～30min，在磁力架上孵育的时间为10～20min。

7.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，步骤s2中第三次离心的条件为：20℃、180～200g、5～10min。

8.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，步骤s2中结合有cd45抗体和cd66b抗体的磁珠的比例为2：1。

9.根据权利要求5所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，步骤s2中向第三离心管离心后的沉淀中加入缓冲液重悬细胞，沉降于载玻片上。

10.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞阴性富集方法，其特征在于，步骤s3中所述多色免疫荧光技术所用的染料为fitc-ck、apc-cd45和dapi。

技术总结
本发明提供了一种循环肿瘤细胞阴性富集方法，包括如下步骤：S1.将肿瘤患者血样进行密度梯度离心，去除红细胞和血浆；S2.加入结合有CD45抗体和CD66b抗体的磁珠进行孵育，通过磁力去除白细胞，阴性富集循环肿瘤细胞。该方法可以使血样捕获背景中的白细胞的清除率达90％以上，中性粒细胞的清除率在75％以上，具有较好的灵敏度，可以在数量较少的样本中稳定的检测出循环肿瘤细胞。

技术研发人员：胡志远,高思颖,吴风收
受保护的技术使用者：武汉工程大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6