一种来源于β-乳球蛋白的纤溶酶抑制肽及其筛选方法和应用

本发明属于生物活性肽，具体涉及一种来源于β-乳球蛋白的纤溶酶抑制肽及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、超高温处理(uht)牛乳是鲜牛乳通过直接或间接加热的方式灭菌的产品，可以常温存放4-6个月。然而，牛乳中耐热的内源酶会导致uht乳在贮藏过程发生变质，尤其是纤溶酶造成的酪蛋白水解，引起uht乳的苦味、沉淀以及凝胶化，严重影响了超高温灭菌乳特别是直接超高温灭菌乳的货架期。因此，想要延长超高温灭菌牛奶的保质期，降低耐热性内源纤溶酶的活性是亟待解决的问题。

2、现有纤溶酶抑制剂的应用通常是用于临床，降低术后出血，尚未有在牛乳中的应用。开发用于乳品中高亲和力的纤溶酶抑制剂，来降低以uht乳中纤溶酶活性，延长牛乳的保质期，具有广阔的应用前景。目前，大多数天然存在的纤溶酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，而欠缺特异性的纤溶酶抑制剂，这主要是因为不同的丝氨酸蛋白酶之间的结构相似性，导致特异性抑制纤溶酶抑制剂的设计存在挑战。此外，已有的蛋白或多肽大多抑制剂中通常含有一个或多个复杂的kunitz型或kazal型结构域，使其难以进行人工合成。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了补充纤溶酶抑制剂在食品领域开发的空白，以及解决目前纤溶酶抑制剂分离提取繁琐/难以快速合成的问题，提出了一种来源于β-乳球蛋白的纤溶酶抑制肽及其筛选方法和应用，利用天然构象的μ-纤溶酶的结构为模板，利用分子对接的方法，从β-乳球蛋白二级结构中灵活的loop结构中挖掘并获取能特异性抑制纤溶酶的小分子短肽，是一种能够快速人工合成的纤溶酶抑制短肽；将该肽添加到新鲜的uht牛乳中，成功消除了在贮藏期间由纤溶酶导致的牛乳不稳地的分层现象，延长了uht牛乳的保质期。

2、本发明的技术方案是：

3、本发明保护一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽，其氨基酸序列如seq id no.1所示，为ektkipav。

4、本发明还保护所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽的筛选方法，包括以下步骤：

5、(1)利用蛋白质数据库获得纤溶酶和β-乳球蛋白的蛋白结构数据，完成纤溶酶和β-乳球蛋白的分子对接，并对β-乳球蛋白和纤溶酶复合体进行200ns的分子动力学模拟；

6、(2)分析β-乳球蛋白与纤溶酶交互作用界面，筛选β-乳球蛋白序列中与纤溶酶活性位点结合的多肽序列；其中，纤溶酶的活性位点为624his、667asp和762ser组成的三联体；

7、(3)根据纤溶酶抑制肽的序列具有在p1位点主要是赖氨酸和精氨酸的特征，结合在纤溶酶活性位点附近覆盖的β-乳球蛋白氨基酸序列，选出合适氨基酸肽段作为目标肽段，并根据序列合成目标肽段。

8、进一步的，所述纤溶酶抑制肽通过固相合成法化学合成，其纯度≥95％。

9、进一步的，所述纤溶酶抑制肽包含8个氨基酸残基，分子量为885.06da。

10、本发明还保护所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备溶纤酶酶抑制剂中的应用。

11、所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备食品添加剂中的应用。

12、进一步的，所述食品添加剂应用于乳品中，作为添加剂加入到uht牛乳中用于延长超高温灭菌乳制品的货架期。

13、本发明保护一种食品添加剂，其活性成分包括所述的纤溶酶抑制肽。

14、本发明保护所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备止血药物中的应用。

15、本发明的有益效果：

16、(1)本发明提供的纤溶酶抑制肽来源于β-乳球蛋白，是首次开展的β-乳球蛋白来源纤溶酶抑制肽的研究，筛选得到1条纤溶酶抑制肽，该肽段含有8个氨基酸，短序列结构简单，作用机制明确，可快速大量低成本的合成，具有良好的应用前景。

17、(2)本发明提供的筛选方法，选择牛乳中β-乳球蛋白作为纤溶酶抑制肽的来源，以μ-纤溶酶的结构为模板，利用分子对接技术获得β-乳球蛋白和纤溶酶复合体，并对接复合体进行室温下的分子动力学模拟以达到平衡状态；通过分析纤溶酶的活性位点附近的β-乳球蛋白氨基酸序列，结合已有纤溶酶抑制剂的氨基酸序列信息，靶向筛选了β-乳球蛋白序列中可能具有纤溶酶抑制活性的多肽序列；本发明依据多肽序列与纤溶酶的活性位点结合的特征，无需经过蛋白水解，直接从β-乳球蛋白氨基酸序列中定向筛选具有纤溶酶抑制活性的氨基酸多肽段。

18、(3)本发明可通过固相合成法合成纤溶酶抑制肽，将该多肽添加到duht牛乳后提高了其贮藏稳定性，延长了保质期，应用前景广阔，解决了特异性纤溶酶抑制剂在食品领域应用的缺乏。

技术特征：

1.一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述纤溶酶抑制肽通过固相合成法化学合成，其纯度≥95％。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述纤溶酶抑制肽包含8个氨基酸残基，分子量为885.06da。

5.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备溶纤酶酶抑制剂中的应用。

6.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备食品添加剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述食品添加剂应用于乳品中。

8.一种食品添加剂，其活性成分包括权利要求1所述的纤溶酶抑制肽。

9.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备止血药物中的应用。

技术总结
本发明属于生物活性肽技术领域，涉及一种来源于β‑乳球蛋白的纤溶酶抑制肽及其筛选方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明选择牛乳中β‑乳球蛋白作为纤溶酶抑制肽的来源，利用天然构象的μ‑纤溶酶的结构为模板，对β‑乳球蛋白和纤溶酶进行分子对接，对复合物进行分子动力学模拟至平衡状态，围绕纤溶酶的活性位点与β‑乳球蛋白序列的交互作用，靶向筛选β‑乳球蛋白序列中可能具有抑制活性的多肽序列，获得一种能够特异性抑制纤溶酶的小分子短肽，能够快速人工合成。将该纤溶酶抑制肽添加到UHT牛乳中，增加了灭菌乳的稳定性，延长了UHT牛乳的保质期，具有良好的应用前景。

技术研发人员：易华西,张太,刘伊索,林凯,刘同杰,公丕民,张喆,张兰威
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25