一种无血清培养驯化贴壁293T细胞的方法及其应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、293t细胞是慢病毒包装的常用细胞，是为提高病毒滴度，经过基因改造而得到的一种细胞。293t可表达sv40大t抗原，在相同实验条件下产生的慢病毒滴度是hek293细胞的4倍。

3、目前科研和工业领域慢病毒包装应用较多的细胞系为293t细胞及其经过无血清驯化的悬浮细胞。这两种细胞在应用中均存在一定的缺陷，贴壁293t细胞培养过程中因需要添加fbs成分，限制了其应用；而经驯化的悬浮细胞，虽然可以利用无血清体系培养，但是慢病毒包装下游纯化深层过滤压力大、杂质残留多，因此其应用也存在一定的局限。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明公开了一种无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法及其应用。本发明通过对293t细胞进行无血清驯化，并在细胞驯化培养过程添加贴附因子以维持细胞贴壁性，最终得到无血清培养的ls293t贴壁细胞系。驯化后的ls293t贴壁细胞在增殖能力、细胞活性均与293t贴壁细胞一致，且病毒滴度和产量方面优于驯化前细胞。在慢病毒包装应用中，ls293t细胞兼具无血清培养和下游纯化压力小的优势，可满足临床级慢病毒生产要求，具有良好的技术优势和应用前景。

2、具体地，本发明的技术方案如下所述：

3、本发明的第一个方面，提供一种无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法，所述方法包括：

4、将dmem完全培养基培养的293t细胞接种至混合培养基中进行培养，得到混合培养基培养的293t细胞；其中所述混合培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为4:1~1:3；

5、将所述混合培养基培养的293t细胞接种至无血清培养基中进行培养，得到ls293t贴壁细胞，其中所述无血清培养基中包含贴附因子；所述贴附因子为重组人纤连蛋白。

6、具体地，所述无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法，包括：

7、s1、将dmem完全培养基培养的293t细胞接种至第一培养基中进行培养，得到第一培养基培养的293t细胞，其中所述第一培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为4:1；

8、s2、将所述第一培养基培养的293t细胞接种至第二培养基中进行培养，得到第二培养基培养的293t细胞，其中所述第二培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为2:1；

9、s3、将所述第二培养基培养的293t细胞接种至第三培养基中进行培养，得到第三培养基培养的293t细胞，其中所述第三培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为1:1；

10、s4、将所述第三培养基培养的293t细胞接种至第四培养基中进行培养，得到第四培养基培养的293t细胞，其中所述第四培养基的组成为：含血清培养基和无血清培养基，所述含血清培养基和无血清培养基的体积比为1:3；

11、s5、将所述第四培养基培养的293t细胞接种至第五培养基中进行培养，得到ls293t贴壁细胞，其中所述第五培养基的组成为：无血清培养基和贴附因子；其中所述贴附因子为重组人纤连蛋白。

12、在一种具体的实施方式中，所述含血清培养基为dmem完全培养基，优选地，所述dmem完全培养基的组成为dmem高糖培养基和胎牛血清，其中dmem高糖培养基和胎牛血清的体积比为40~50：5。本技术的培养过程中对培养基不做具体限定，所述含血清培养基也可采用其他常规的细胞培养基。

13、在一种具体的实施方式中，所述无血清培养基为optiprosfm完全培养基，优选地，所述optiprosfm完全培养基的组成为optiprosfm培养基和谷丙氨酸二肽（glutamax-i），其中optiprosfm培养基和谷丙氨酸二肽的体积比为48~50：1。本技术的培养过程中对培养基不做具体限定，所述无血清培养基也可采用其他常规的细胞培养基。

14、在一种具体的实施方式中，所述重组人纤连蛋白在无血清培养基中的浓度为15~25 μg/ml，优选为15、20、25 μg/ml，进一步优选为20 μg/ml。

15、在一种具体的实施方式中，将293t细胞在培养传代的过程中按照细胞代次1~5传代培养，进行无血清培养基替换比例控制为6次；细胞驯化总传代不超过20代。

16、在一种具体的实施方式中，所述将所述第四培养基培养的293t细胞接种至第五培养基中进行培养，得到ls293t贴壁细胞之后，还包括：将所述ls293t贴壁细胞使用无血清细胞冻存液进行冻存。

17、在一种具体的实施方式中，所述将dmem完全培养基培养的293t细胞接种至第一培养基中进行培养，得到第一培养基培养的293t细胞，包括：

18、消化dmem完全培养基培养的293t细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293t细胞接种至第一培养基，将所述第一培养基放入37℃、5% co2的培养箱中进行培养。

19、在一种具体的实施方式中，所述将所述第一培养基培养的293t细胞接种至第二培养基中进行培养，得到第二培养基培养的293t细胞，包括：

20、消化第一培养基培养的293t细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293t细胞接种至第二培养基，将所述第二培养基放入37℃、5% co2的培养箱中进行培养。

21、在一种具体的实施方式中，所述将所述第二培养基培养的293t细胞接种至第三培养基中进行培养，得到第三培养基培养的293t细胞，包括：

22、消化第二培养基培养的293t细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293t细胞接种至第三培养基，将所述第三培养基放入37℃、5% co2的培养箱中进行培养。

23、在一种具体的实施方式中，所述将所述第三培养基培养的293t细胞接种至第四培养基中进行培养，得到第四培养基培养的293t细胞，包括：

24、消化第三培养基培养的293t细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293t细胞接种至第四培养基，将所述第四培养基放入37℃、5% co2的培养箱中进行培养。

25、在一种具体的实施方式中，所述将所述第四培养基培养的293t细胞接种至第五培养基中进行培养，得到第五培养基培养的293t细胞，包括：

26、消化第四培养基培养的293t细胞，制成细胞悬液，取样计数，按照2×104~1.0×105个/cm2将293t细胞接种至第五培养基，将所述第五培养基放入37℃、5% co2的培养箱中进行培养。

27、本发明中，细胞培养过程中操作要轻柔，避免剧烈晃动和吹洗，期间观察细胞贴壁情况及细胞增殖情况，至细胞完全适应该比例的培养基时，再进行下一比例培养基适应性培养。

28、本发明的第二个方面，提供上述无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法培养得到的ls293t贴壁细胞。

29、本发明的第三个方面，提供上述无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法和/或ls293t贴壁细胞在如下任意一种或多种中的应用：

30、a）培养扩增；

31、b）慢病毒包装。

32、需要说明的是，驯化后的ls293t贴壁细胞具有更佳的转染效率和更高的病毒滴度，从而更加有利于将其应用于慢病毒包装。

33、需要说明的是，培养扩增的应用中，ls293t贴壁细胞活性和扩增正常，慢病毒包装的应用中，ls293t贴壁细胞进行慢病毒包装，慢病毒感染滴度高，从而更加有利于将其应用于慢病毒载体生产。

34、本发明具有以下有益效果：

35、本发明中提供的无血清贴壁293t细胞的驯化培养方法，通过培养基逐级替换、添加贴附因子，获得无血清体系贴壁ls293t细胞，通过检测细胞活率和增殖倍数，发现ls293t细胞活率高增殖速度与293t细胞无差异；利用驯化得到的ls293t贴壁细胞进行慢病毒包装，质粒转染效率高，获得的慢病毒滴度效果良好。兼具无血清培养和下游纯化压力小的优势，具有良好的技术优势和应用前景。

36、本发明中的无血清培养驯化贴壁293t细胞的方法操作步骤简单，可操作性强，便于推广，同时效果极佳，因此具有良好的实际应用之价值。