基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种miRNAs的方法及应用

本发明属于生物医学领域，具体来说，涉及一种基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种mirnas的方法及应用。

背景技术：

1、microrna(mirna)是约20-25个核苷酸的短非编码rna分子，在转录后水平的基因表达调控中起着至关重要的作用。研究发现，异常mirna表达有助于包括肿瘤在内的多种疾病的发生和进展。在膀胱癌发展过程中，mirna参与包括逃避细胞凋亡、维持细胞增殖、促进上皮到间充质转化、诱导血管生成和形成炎症性肿瘤微环境等多种路径。因此，mirna可作为膀胱癌诊断和预后的潜在标志物。此外，mirna存在于唾液、血液和尿液等体液中，可以用于液体活检，有助于实现膀胱癌患者的非侵入性的诊断及预后监测。

2、目前检测mirna常规的方法，包括实时逆转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)、第二代测序、northern印迹杂交和微阵列等。这些方法受到mirna自身低丰度，高序列相似性或仪器复杂且耗时的限制，难以实现临床环境下的简便、快速、灵敏度检测。为了提高mirna检测的灵敏度，开发了多种核酸信号放大策略，包括催化发夹自组装，滚环扩增等。然而，这些放大策略伴随着复杂的探针设计或多种酶的参与，增加了实验繁琐性，并阻碍了mirnas多元检测的能力。

技术实现思路

1、技术问题：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种mirnas的方法及应用，可以实现简单快捷、高灵敏、高特异、多种mirnas的同时检测。

2、技术方案：为解决上述技术问题，本发明实施例采用以下的技术方案：

3、第一方面，本实施例提供一种基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种mirnas的方法，所述方法包括：

4、步骤10、制备粒径均一的褶皱硅球wsns；

5、步骤20、将所述褶皱硅球表面偶联s9.6抗体，得到wsns@ab；

6、步骤30、将靶标mirnas互补的单链dna修饰至量子点表面，得到核酸功能化量子点qds-ssdna；

7、步骤40、将不同浓度靶标mirnas与步骤30制得核酸功能化量子点反应，得到qds-ssdna/mirna杂交双链；

8、步骤50、将步骤20制得的wsns@ab与步骤40制得的qds-ssdna/mirna杂交双链共孵育，经过离心、洗涤，得到终产物wsns@ab/qds-ssdna/mirna；

9、步骤60、检测步骤50得到的wsns@ab/qds-ssdna/mirna溶液的荧光强度；根据终产物荧光强度和相应的靶标浓度，得到线性方程；

10、步骤70、提取待测样本总rna，将步骤30制备的核酸功能化量子点与待测样本总rna共孵育，再加入步骤20制得的wsns@ab，检测终产物的荧光强度；根据所述步骤60得到的线性方程，计算待测样本中靶标mirnas浓度。

11、作为优选例，所述步骤10包括：将溴化十六烷基吡啶和尿素溶解在超纯水中，并向其中加入环乙烷和异丙醇，室温条件下剧烈搅拌；然后逐滴加入原硅酸四乙酯，反应后，将产物用乙醇洗涤，干燥煅烧，制得粒径均一的褶皱硅球。

12、作为优选例，所述步骤10中，制得的褶皱硅球的直径为140±5nm。

13、作为优选例，所述步骤20中，褶皱硅球与s9.6抗体质量比为1:1～15；所述步骤20还包括，将表面偶联s9.6抗体的褶皱硅球，放入牛血清蛋白溶液中，牛血清蛋白溶液质量浓度为0.1～1％。

14、作为优选例，所述步骤30中，量子点选择巯基丙酸修饰的cdse/zns水溶性量子点。

15、作为优选例，所述步骤30中，靶标mirnas与膀胱癌相关，包括mir-135b、mir-21和mir-96。

16、作为优选例，所述步骤30中，量子点为蓝色量子点bqds、绿色量子点gqds、红色量子点rqds；设计靶标mir-135b、mir-21和mir-96互补的单链dna分别为ssdna1、ssdna2和ssdna3；制备的核酸功能化量子点包括bqds-ssdna1、gqds-ssdna2、rqds-ssdna3。

17、作为优选例，所述步骤40中，核酸功能化量子点用量为5-25μl。

18、作为优选例，当靶标mirna不存在时，核酸功能化量子点不能被s9.6抗体识别捕获；当靶标mirnas存在时，能够与相应的核酸功能化量子点形成杂交双链，s9.6抗体能够特异地捕获杂交双链，从而将量子点结合至褶皱硅球表面；通过检测褶皱硅球表面量子点的荧光强度，实现靶标mirnas的定量分析。

19、第二方面，本实施例提供一种所述基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种mirnas的方法在血清mirnas检测中的应用。

20、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的一种基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的检测多种mirnas的方法及应用，可以实现简单快捷、高灵敏、高特异、多种mirnas的同时检测。本发明的检测方法，首先制备褶皱硅球，褶皱特性帮助实现与更多的s9.6抗体共价偶联。s9.6抗体能够灵敏并特异地捕获靶标mirnas与量子点偶联的单链dna杂交双链。因此，核酸功能化的量子点根据实际靶标的多少被捕获在硅球表面。通过荧光分光光度计检测特征吸收峰处荧光强度，实现对mirnas的多元检测。同时，本发明可基于三种核酸功能化的量子点，用于血清中多种膀胱癌相关mirnas的同时检测，为检测mirnas提供了一种无创性、灵敏性、特异性、多元性的新方法。在膀胱癌的无创早期诊断和预后监测方面具有广阔前景。

技术特征：

1.一种基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种mirnas的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤10包括：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤10中，制得的褶皱硅球的直径为140±5nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤20中，褶皱硅球与s9.6抗体质量比为1:1～15；

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤30中，量子点选择巯基丙酸修饰的cdse/zns水溶性量子点。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤30中，靶标mirnas与膀胱癌相关，包括mir-135b、mir-21和mir-96。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤30中，量子点为蓝色量子点bqds、绿色量子点gqds、红色量子点rqds；设计靶标mir-135b、mir-21和mir-96互补的单链dna分别为ssdna1、ssdna2和ssdna3；制备的核酸功能化量子点包括bqds-ssdna1、gqds-ssdna2、rqds-ssdna3。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤40中，核酸功能化量子点用量为5-25μl。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当靶标mirna不存在时，核酸功能化量子点不能被s9.6抗体识别捕获；当靶标mirnas存在时，能够与相应的核酸功能化量子点形成杂交双链，s9.6抗体能够特异地捕获杂交双链，从而将量子点结合至褶皱硅球表面；通过检测褶皱硅球表面量子点的荧光强度，实现靶标mirnas的定量分析。

10.一种权利要求1～9所述基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种mirnas的方法在血清mirnas检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于抗体修饰褶皱硅球联合核酸功能化量子点的同时检测多种miRNAs的方法及应用，可实现简单快捷、高灵敏、高特异检测。该方法包括：褶皱硅球表面偶联S9.6抗体，得到WSNs@Ab；将靶标miRNAs互补的单链DNA修饰至量子点表面，得到核酸功能化量子点；将不同浓度靶标miRNAs与核酸功能化量子点反应，得到QDs‑ssDNA/miRNA杂交双链；将WSNs@Ab与QDs‑ssDNA/miRNA杂交双链共孵育，得到终产物；检测终产物的荧光强度，得到线性方程；根据线性方程，计算待测样本中靶标miRNAs浓度。

技术研发人员：王佩,屈晓君,朱叶飞
受保护的技术使用者：南京医科大学第二附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22