一种高效捕获、富集环境中微量核酸的方法及应用

本发明属于分子生物学检测。更具体地，涉及一种高效捕获、富集环境中微量核酸的方法及应用。

背景技术：

1、核酸检测灵敏度高，特异性强，因此在科学研究、疾病防控、法医、生物安全和医学应用中是一项极为重要的检测手段。如：生物学或医学实验室检测基因；疾控中心和海关检测病原体基因；血液中病原体核酸检测诊断疾病；体液中核酸检测用于疾病早诊和确诊等。随着核酸药物的临床应用，检测受试者核酸药物在体内的分布和代谢，也依赖于核酸检测。通常上述检测要求目标样品达到适当浓度才能进行，在一定程度上极大地限制核酸检测技术的应用。

2、另外，以空气、水体等环境介质传播的病原体(尤其是病毒)，种类繁多、传播隐蔽、传染性强、易变异、突发性强，难以防范。检测环境中的病原体基因组核酸对传染病防控有重要价值。但因环境中核酸含量非常少，现有的技术难以进行直接检测，目前常用捕获核酸的方法是离心法和过滤法：中国专利申请cn110106169a公开了一种提高无细胞体液中微量核酸捕获率的方法，该方法是通过高速离心的方式实现核酸的富集，但该方法对专业实验室设备的要求非常高，并且当溶液体积过大时，也无法实现微量核酸的捕获；而过滤方法也不适用于大体积溶液核酸的捕获。受空气中病原体微生物浓度的限制，目前对于空气中微量核酸检测的技术手段更是匮乏，还没有一种灵敏度高、并且能高效捕获病毒或细菌核酸的技术。

3、可见，因环境中目标核酸浓度较低，监测环境中病原体核酸仍存在较大的技术困难。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术无法检测环境中浓度较低的核酸的缺陷和不足，提供一种高效捕获、富集环境中微量核酸的方法。

2、本发明的另一目的是提供所述方法在环境核酸检测中的应用。

3、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

4、一种高效捕获、富集环境中微量核酸的方法，具体包括以下步骤：

5、将带表面尖刺的二氧化硅纳米球制成悬浊液，与样品充分接触、吸附核酸，分离出二氧化硅纳米球，用释放溶液进行洗涤释放出核酸，即可；

6、其中，所述表面尖刺的二氧化硅纳米球的刺长为10～100纳米；所述带表面尖刺的二氧化硅纳米球经过正电荷官能团进行修饰；

7、所述释放溶液为0.1～5摩尔/升的碳酸氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠溶液，或ph为11～14、浓度为0.1～10毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷溶液。

8、进一步地，所述带表面尖刺的二氧化硅纳米球的总粒径为100～200纳米。其中，纳米球由中间的一个球体和外周的刺组成，所述总粒径将中间球体和外周刺长计算在内。

9、更进一步地，所述碳酸氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠溶液的ph为8.56～9.45。

10、进一步地，所述正电荷官能团选自氨基、精氨酸、聚乙酰亚胺中的一种或多种。其中，所述氨基修饰时，可采用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷进行。

11、更进一步地，所述样品为核酸未暴露样品时，通过裂解液使核酸释放。

12、进一步地，所述裂解液包括以下组分：十二烷基硫酸锂0.01～0.05％、聚乙二醇辛基苯基醚0.5～3％、异硫氰酸胍0.5～1.5摩尔/升、三羟甲基氨基甲烷0.1～1摩尔/升、氯化钠100～200毫摩尔/升。

13、优选地，所述分离的方法为离心。

14、另外的，本发明还提供了所述方法在环境、生物体液核酸检测中的应用。

15、优选地，所述核酸检测的方法包括rt-pcr、pcr或琼脂糖凝胶电泳。

16、进一步地，所述核酸检测在空气样本中病毒的检测下限降低至500拷贝/升。

17、更进一步地，所述核酸包括环状dna、双链dna、单链dna、环状rna、双链rna、单链rna或小rna；或核酸类似物、核苷类似物，指替代或修饰了天然核糖核酸和脱氧核糖核酸的戊糖、磷酸和碱基中的至少一种，其中替代或修饰戊糖的类似物种类包括但不限于肽核酸(peptide nucleic acid，pna)、吗啉(morpholino，mna)、桥核酸(bridged nucleic acid，bna)锁核酸(locked nucleic acid，lna)、乙二醇核酸(glycol nucleic acid，gna)和苏阿糖核酸(threose nucleic acid，tna)，以及改变糖环的构型、大小或引入杂原子等；通过替代或修饰磷酸的类似物种类包括但不限于硫代修饰、硼酸基取代等。核酸类似物为骨架的化合物除特指包含有核酸类似物的寡聚和多聚物外，还包括对天然多聚核酸的其它常见修饰，如甲基化修饰、乙酰化修饰等。

18、进一步地，所述环境包括水体环境和空气环境。

19、优选地，所述生物体液包括但不限于血液、尿液、唾液。

20、本发明具有以下有益效果：

21、本发明提供了一种高效捕获、富集环境中微量核酸的方法，该方法利用带表面尖刺的二氧化硅纳米球去捕获、富集样品中微量的核酸，再利用释放溶液将紧密吸附在二氧化硅纳米球上的核酸充分洗脱、释放出来，进而对核酸进行检测，具有较高的灵敏度，可将空气样本中病毒的检测下限降低至500拷贝/升，显著优于现有技术的检测方法，非常适于检测水体、空气等环境或血液、尿液、唾液等生物体液中的微量核酸，用于病原体、环境微生物和核酸生物标志物的检测。

技术特征：

1.一种高效捕获、富集环境中微量核酸的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述带表面尖刺的二氧化硅纳米球的总粒径为100～200纳米。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述碳酸氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠溶液的ph为8.56～9.45。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述正电荷官能团选自氨基、精氨酸、聚乙酰亚胺中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样品为核酸未暴露样品时，通过裂解液使核酸释放。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述裂解液包括以下组分：十二烷基硫酸锂0.01～0.05％、聚乙二醇辛基苯基醚0.5～3％、异硫氰酸胍0.5～1.5摩尔/升、三羟甲基氨基甲烷0.1～1摩尔/升、氯化钠100～200毫摩尔/升。

7.权利要求1～6任一所述方法在环境、生物体液核酸检测中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述核酸检测在空气样本中病毒的检测下限降低至500拷贝/升。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述核酸包括环状dna、双链dna、单链dna、环状rna、双链rna、单链rna或小rna。

10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述环境包括水体环境和空气环境。

技术总结
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种高效捕获、富集环境中微量核酸的方法及应用。该方法利用带表面尖刺的二氧化硅纳米球去捕获、富集样品中微量的核酸，再利用释放溶液将紧密吸附在二氧化硅纳米球上的核酸充分洗脱、释放出来，进而对核酸进行检测，具有较高的灵敏度，可将空气样本中病毒的检测下限降低至500拷贝/升，显著优于现有技术的检测方法，非常适于检测水体、空气等环境或血液、尿液、唾液等生物体液中的微量核酸，用于病原体、环境微生物和核酸生物标志物的检测。

技术研发人员：王鑫,仇萌,付建冶,张雪,吕尚优,虞亚敏
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15