大麦钙调蛋白结合蛋白基因HvCBP60b及其在调控大麦抗盐性中的应用

本发明属于生物基因工程，尤其涉及大麦钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b及其在调控大麦抗盐性中的应用。

背景技术：

1、土壤盐碱化是限制作物生长和产量的一种非生物逆境，严重制约粮食安全和农业可持续发展。目前，全球超过1/3的土地已受到盐碱化的影响。不同植物的耐盐性差异巨大，水稻、小麦等大多数作物属于甜土植物，对盐表现敏感，通常在100mm nacl环境下生长就受到严重抑制，甚至死亡，而一些盐土植物，如海大麦、藜麦等，可在高于300mm nacl环境下基本正常生长、发育。“转变育种观念，即由治理盐碱地适应作物向选育耐盐碱植物适应盐碱地转变”，为耐盐碱作物育种提出了任务并指明了方向。发掘耐盐基因并明确其功能是开展作物耐盐育种的基础与前提。

2、盐胁迫对植物的危害主要是由于高渗透和高浓度盐离子所致，并继而引发次生氧化胁迫影响植物的生理生化和代谢过程。通常，高浓度的盐离子(如na+)改变土壤的基本属性，导致土壤孔隙度降低，从而减少土壤通气性和导水性，进而减弱植物吸收水分的能力，限制植物的生长。其次，植物细胞内na+等离子的过度积累会抑制酶活性，破坏植物代谢，甚至导致植物死亡。细胞质是多种代谢的主要场所，包含许多参与初级代谢、卡尔文循环、苯丙烷途径、糖酵解以及多胺和淀粉合成的酶物质，而这些酶大多受到k+的调控。由于k+和na+的化学性质相似，通常认为细胞内高浓度的na+可在这些酶促反应中代替k+，从而降低代谢效率，进而产生毒害作用。

3、钙离子(ca2+)是一种普遍存在的第二信使，在几乎所有生命形式的多种信号转导机制中发挥着关键作用。盐胁迫会在几分甚至几秒内引发细胞质ca2+浓度的增加,表明ca2+是响应盐胁迫的早期信号之一。有研究发现植物受盐胁迫时，整个根部内皮细胞中细胞质ca2+浓度很快显著增加。另外，植物在盐环境中叶片中易产生系统性的钙离子波动。因此，盐胁迫过程中的钙信号是一种相当复杂的现象，钙离子信号在整个植物对盐胁迫的反应中具有核心作用。环境中的盐离子浓度，可以快速而强烈地调节细胞溶质内的ca2+浓度。因此，适当调节细胞溶质ca2+水平对细胞存活至关重要。在细胞中已发现了多种ca2+感受器，其中含有ef-hand的蛋白分子可能在植物钙信号传导中起主要作用。通常，含ef-hand的蛋白质可主动结合ca2+，即螯合细胞溶质中的钙，从而调节钙的稳态。钙调蛋白(cam)即是含有ef-hand并能与ca2+结合的一种感受器，它主要通过捕捉细胞内变化的ca2+信号，形成ca2+/cam复合体，进而将这种信号传递给下游基因或反应。其中，一些转录因子可能被ca2+/钙调蛋白直接激活，包括钙调蛋白结合转录因子(camtas)、gt-元件结合样蛋白(gtls)和mybs,而这些转录因子反过来可调节各种基因的表达水平，并最终影响植物耐盐性。

4、大麦是全球第四大禾谷类作物，其用途且集粮食、饲料和啤酒原料于一体，并具有较强的耐盐性，是研究作物耐盐机制的理想材料。前期研究发现钙调蛋白hvcam1具有负调控耐盐性的生物学功能，并推测其对耐盐性的调控是通过与hvcbp60b结合而实现的。钙调蛋白(cam)结合蛋白60类(cbp60)蛋白是植物非典型转录因子，拟南芥基因组cbp60a-g和系统获得性抗性缺陷1(sard1)共编码8个成员，cbp60g和sard1在病原菌入侵过程中介导免疫基因的表达，在植物免疫中扮演重要角色。最新研究表明，cbp60b在病原菌诱导的防御中与cbp60g和sard1一起发挥冗余作用，但cbp60b在基础防御上起关键作用，部分是通过直接调节cbp60g和sard1来实现的。此外，有研究表明，cbp60g和sard1也与非生物胁迫反应有关，这两种基因在寒冷胁迫下表达增强，而cbp60g过表达可提高植物的耐旱性，cbp60g敲除株系则表现对干旱胁迫更敏感。但是，迄今尚未有过cbp60响应盐胁迫的相关报道，亟待研究明确。

技术实现思路

1、本发明提供了一种大麦钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b及其在调控大麦抗盐性中的新用途。

2、具体技术方案如下：

3、本发明提供了一种钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b，其核苷酸序列为seq idno.1所示。本发明首先克隆得到一个大麦的钙调蛋白结合蛋白编码基因，命名为hvcbp60b，其转录本cdna全长核苷酸序列为seq id no.2所示。

4、seq id no.1：atgaacgagaagcgcgggctggaagcggccgccgccggcgacgg ccgccccgaggctaagcggtcgcgccccccggctcttgccaggtcaggaattcgtcgagtttcggtaccccttttaagtgcgtgcgtgatgtgatttttgtgtgtccgtgccgattcagccgcgcgagttctagccagtgtagctgcttgggttcgtatagtggcaaaggctttcgtgatttagcgccggcttacgtatttataactgagatttgggaattcatcttcagattaattgctcgcgatttggtgccgtctagctgagaatctgaagatgtattttttttttattgacaaagggtcgtcaggttgttattagcggggtgatgattagtctcctagttatggttttgatgaccatgggcgttttgaagttgccttttggtgttatgtactccttagtattagaaacaatttgagctggaactggtgtgacctgctgggaaatgagtgaattattggtaacttggtggttaactgttgagagaaaggacaagatccgttataagtagtttcaggagcacactcgtgaccacgttataagcatcaaggacgtacactcaaggacgcctatgcttaccactgaaaacaatttaagaaaaatgtatacatcatccatcacatattaggacaaaatcaaatgccaggcttgttctgtagctttaactccaggcttgtcatccactctattctgttgttagtataatattttaacctcatgcacataagttaagcaaatacataagattaccactgtggccttgttaaaattatctcattgaacttgtccaacaagaatctccctagttaatggcaagaactatctctaaagcgctatcttctgggcgttatgtttataggcataatctccatactattctcctatttatttgaatagccaaagcttaaacattgtttagtgtgaccatgtgaacatatataagcagttccagtgcaattggcacatggcatattcttggttgtggtctgtgtgaacatgcggtgttggatacttagatgtgctacagactacataaatcattgtaggacagttaagaagtactccctccgtcccaaaataactgtctcgactttgtactagctctaatataaagttatactaagcttaagacagttattttgggacggacggagtattattttaccatctttcagtaaccagtgtgtctcttttgctttcatgtatctgtacttgtaattctgtttcgtaatgctagcagaagactgtcaagtgctgtaacattatgatgttgagctgtggccggttgaatattagctaagtattatcttaaatggttttagtgaacattttttctgttgggtttaccttttaattggaacaacgtttaatcatggcctttatacttattcattgtacttgtacagtgttattgttgaagcactaaaggtggatagtctgcagaggctttgctcatcattggaaccaattctccgtagagtggtaagaacaaagcaagtattaagcaggaatgcagttatgacatatctttgtggagttgcaaaatgtctattgacattttgtgtttctttctgttggttgtaatatgattaatttcgtattttgcttgtaggttagtgaagaagttgagcgcgccttgggaaaacttggtcctgctgcaatcactgggaggtatgacatctaaccaacaatgaagcaaatatattagtttctttgttaaaaagtcgatatgttactttccatttaagatgcaccaaaccgtttgtttggtgctttctccatgttgtgttatgtacctgacacggatatgcctcatgtggtatgtatcagattatttttgaaatatttgtacacactgtacatggctatgcagccctctgccagaaaagaaagctcatcaaacaacctaagcatgacctctaaccctaccttgacataggagtatgcgagtagccaagctatagcttccctctcctattgacacccacatacattcctcccccatctacaggtccatctcttggcgtaaatggggcacaatcggttccgttccgtttataattttttctctgtttcaatctatagactcatgttacacctgacttccggactgcaataaggaagtgggatatttcttatggttgattttgcacagaaatcgaagatattttatgtggcttattatgttttacttggagaccccatattgtcagtgtcaattctagactagaggaactacactattggatacttcataagttttcaaatgtatatgtagcgttgtcagtttgtcaaggaaaaaacatgtatcaccatagcctactttttcattataccttttagctgtgcacttcattcgtttcaaaatagatgtccatctagggttaggcatagaaatgaagagtgagtgaaatgtcaatattgcccttcactcatttctgtctccatatacttttcctcaccaaggcattaaatgatacctctttttcctcccccaagcaacacctgcaagcaaaagatgggttattgggaattgcaaacatgaggaagagttaattatctcttatcttctactacgttgttgacgggaaaaaaagagtaaagtgactaaaatgtattggaggtgcaggagggcattattttgaaatggaaggagtatggcacgtaacaccctttccttactgaattgtagaatatattaatatggtgcaagtaacacatgatggtattgccagtaacttgatgtttgtggtgtgcaatgtaatttggcttcacgcgtcatgctatatcctcgcaaagtatgtaaactttgaggcctaaaagatgaaatggccttctttgggagccacattgatactaattatctgctactgattggaataatgcaggtcttctccaaagcgaattgaaggtcctggtggaagaaatctgcaactccaattcaggacaagattgtcccttcccctttttaccgggggaaaagttgaaggggagcagggggctgcaattcatgttgttttgcttgataccagcaatggctgtgttgtatcatctgggccagagtcgtctgccaagcttgatattgttgttctagaaggcgatttcaacaatgaagatgaggaaggctggacagaggaggaatttgacagtcatgtagtgaaggagcgtgagggaaaacgacctattataactggcgatatacaagtcacactaaaagacggtgttggcacaattggggagttcacgttcacagataactctagctggataaggagtaggaaattcagacttggtttgaaaattgcctcagggttttgtcaaggtgttcgcatccgtgaggcaaaaactgaagctttcatggttaaggaccatagaggagaatgtaagttttctgtaatggtaatcatgtgcttccgcttgagatatgtctgaacaatttgaatttcacttctttagtgtacaagaagcattatccacctgcattgaaggatgaggtctggaggttagagaaaataggaaaagatgggtcgttccataagaggctgaataaatctggaattttaactgttgaagattttctcaggcttgttgttcgggatccacagaagttgcgtactgtaagttcgtttctttccatggcctttgatctattgctgttgtagttctaatttgtatactattctgttgttttagatagttcgtttctttccacggcctttgatctattgctgttgtagttctaatttgtatactgttctgttgttttagatcctcggaagtggcatgtccaacaagatgtgggattctctcgttgaacatgcaaaaacctgcgtcttaagtggaaaatattacatatactattctgatgagcacagaactgctggtgctattttcaacgacctctatgcattctgtgggttgatttctggcgagcaattctattcatctgaaagtctcgatgatggccaaaaggtttgtgctatgggcatatatttgggggcatttgatatctagtgttatgttttattgaatttaaaggttgtttccattcattttaacatgcacccatcctagataatgaaactaaatttgtattgttttggagttttgaaattggtatgctctctgttcctgattctagggtgctttagtttgggcgtcaatattaaggagtgtgggcatggacatgattagttgagagttggtcgattttgctctcactcttgtcttagaagttcatctcatgcagagtctgcatatcttgcttgccctgatctctgctcaccaatagtctgcctactattgaacatgctacatggaaggagatgttccagagattttgtttccagtatatggtcgggtcgtttagattttggaagttcagggatctttagcgtttttactatggtaggggaacaggaacgtcatgtatgcaggagtattatcaggagaaaggaggagaaaaacctccagggccctagatctgggaaaagacgaccaaggaactgtgattgagggagtaatatgtagatgtctgacttcatcctatatcacattggtcttgatctgtccacaccctttatattccaagaatggtggccatggatagtgtgtattaactattaatttctggaaccgttatatgtttttaacgcactaaatgctcattaggtacgttctctttgctgatgggctggtgaagaaagcatatgataattggatgtatgttattgaatatgatggtaaagctctcttgaaccctaaaccgaagaaaaaggctgcattaactagtcaacctgaggctcgtgctcctgctgcatatgtacagcgcatttcttcaacgagtatgccaggaccatctacagcaggtaagtagcacacaagtgcttagttacagaattccaagtatttttacgattttacttcagaagtaggaaaat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5、seq id no.2：atgaacgagaagcgcgggctggaagcggccgccgccggcgacggccgccccgaggctaagcggtcgcgccccccggctcttgccagtgttattgttgaagcactaaaggtggatagtctgcagaggctttgctcatcattggaaccaattctccgtagagtggttagtgaagaagttgagcgcgccttgggaaaacttggtcctgctgcaatcactgggaggtcttctccaaagcgaattgaaggtcctggtggaagaaatctgcaactccaattcaggacaagattgtcccttcccctttttaccgggggaaaagttgaaggggagcagggggctgcaattcatgttgttttgcttgataccagcaatggctgtgttgtatcatctgggccagagtcgtctgccaagcttgatattgttgttctagaaggcgatttcaacaatgaagatgaggaaggctggacagaggaggaatttgacagtcatgtagtgaaggagcgtgagggaaaacgacctattataactggcgatatacaagtcacactaaaagacggtgttggcacaattggggagttcacgttcacagataactctagctggataaggagtaggaaattcagacttggtttgaaaattgcctcagggttttgtcaaggtgttcgcatccgtgaggcaaaaactgaagctttcatggttaaggaccatagaggagaattgtacaagaagcattatccacctgcattgaaggatgaggtctggaggttagagaaaataggaaaagatgggtcgttccataagaggctgaataaatctggaattttaactgttgaagattttctcaggcttgttgttcgggatccacagaagttgcgtactatcctcggaagtggcatgtccaacaagatgtgggattctcttgttgaacatgcaaaaacctgcgtcttaagtggaaaatattacatatactattctgatgagcacagaactgctggtgctattttcaacgacctctatgcattctgtgggttgatttctggcgagcaattctattcatctgaaagtctcgatgatggccaaaagctctttgctgatgggctggtgaagaaagcatatgataattggatgtatgttattgaatatgatggtaaagctctcttgaaccctaaaccgaagaaaaaggctgcattaactagtcaacctgaggctcgtgctcctgctgcatatgtacagcgcatttcttcaacgagtatgccaggaccatctacagcaggctcaaatggttctatagggtatgatggcaaccagacagcaacacagtctgttcagcttcagagttcatctgctaatgtgccgttgccatatgatgaggccttttcatttttgccgcctaccatgttgatgggttctaatcaaggaacagcaagtgatgccatgggtctggaactcagccaattgcatcacacaatttctcaagcccatccaattcaaccagcaaatgtcagctacgataattggcatcacaaccgtgatagtcagtatgctgatgatttcaccgaagacattcgcatgaaaagccaccaactgctcgagggtgaagacatgcagcagctgctcagggtcttcaatatgggtggagcttctcctggtttgccagacgagacgttttcctaccagacctacatgccatctccattgccaaccccaggcttcgaaggtgagcccagccgtccatcgggcaaagccgttgttgggtggctcaagataaaggccgctatgaggtggggaatatttgtcaggaagaaagctgcggagagaagggcacagattgttgagctggatgattaa。

6、本发明还提供了hvcbp60b基因启动子，该启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示。该启动子为3kb，用于引导该基因在植物细胞中大量表达，以满足快速合成钙调蛋白结合蛋白和响应各种刺激或胁迫所需。

7、seq id no.4：aagatgagagggaaggggtgcgcccctgacacgcgttttcaaata ccgaatcacgttcgacgaataaccgaagacgacgcagctacggtcgaccgttcgggtacgagacggactccgattgcgatgaaatttggcaagcggcctagctacaactaattaagaccgcacgccaagtttcaactcaatcagagaatattttacacacacttttaaaacagggtttaatcgatgccgcgggcgcgtatgtgtgcggtcgggctcagaacggacaacgacgagaaccggcaactaataacggacacaagttttgaaaactagcggcaacgggatgccgatgcaatgcggatgatgcgacaagtaaaaatagacacacgacgaaaacggaataaaggggggaatcttctggaacgtcggtctcgggctgtcacagtcggttggcctcgttctggtggcggtgacgggctatgttgcggcggcacatcatcccccttcaaattggcgccagcgtcgagggcctggtggattgctcggcgtcatctgatcagatatactatggccgatgcagccgacagtggcggtcatctcctccgtataggtggtcgacctgaggctgggtggttggatctcgcgatccatcatccagtcctggctgtgagtcgggaagacatagttgtcggtgaaaaccgagctgatggcggcgttccgcgtcgttaccttgatgaaggcatcatcgtgtaactactgttgacccactcatgatgcttagggggaaaccctaagatctgatcgtcagatcggacgatggcggcactacggtgtcttgcctcttttgggagcatcgtttctggagcagcgctggatgatagaggaaggcgatggagcgacttcgtcttgatcggagctttggtggagatgtcaagtcatgcctgggcgacaggtgctacgttgtgtcatgcctgctcgacaggtgctacgcacgacagatctttcagagccttcatgtcaggatggacgagcgcaggacggtggcgccgttgggcgtcgtggtggtgtcgacggatggacgaactggcaagggtgatacagatctctctcctgaaaatgggacagtggttcgatgatgatggcggcttctaaaacgtgtgcaagtggtatacgatttaagtttgctgcaccgtttgttttttcgatacgttatagggatggataggtgatgacaacggtttttgatatggagagtgagagcattcaatattatcatgtttgtaggtgtgagtgatggcttcggatggcttaatgtatgatcttgtcagacctttgtgtaataattaataaaaatggtgtatgcatcaattgatgtagatgccgagggttgaaccttcttttctaaaacaaagtaagagttaccgaaaaccaaacatatttccttgcatttttctggtgaaaaatacatacttcctctcataaagagctagcatttagttcatcaccaaaatggaccctcgcgaaccagtcttcattgacttactcccactttctcttggttacttgggtacaaaagcagtactccctttttcaaaataagtgtcataatttaaattaaaattagtttagaactgcaacacttagggggtgtttgtttccacggactttttggtgcagggactaaaaaaagtcccttttagtcccatgtgaaacaaacaggagggacttttagggactaaaagggggtatttgggactaaaggaagaagtccctatgggagggtctttttgggactttttgacactttttccaatattgcccctacttttagcatgttatttaataactactacaacattactaggggtaacatggtctttttgcatgttatttaatgacctctaatctctgtttagtccatgaaaacaaacgggtagggactagggactttttagttgggacttaaaaaagtcctgggatttctgaaacaaacaaggccttattatggatctgagggagtactaattactccctccgttcctaaatataagaccttttaaagattgtactataaactacatacggatgtacatagacatattttagagtataaattcactcattttgcttcgtatgtagtcttctaataaaatacctaaaaggtcttatattttaagacggagggagtattatcgtatctacttcaatagactgctaaatcttgccctaatatgaaaatgcggaggtcgctactacaagtagaaactgaaaaagataataataagagaaagggttttgagcacaacaaacctgcgcgagcgctgccggtgccgacaccgacgcccaggaggaagccaccgtgcgacatgactccgacgacggctatggggagcagtcggagccggggacgaggagcagctatcacttcctcgtgggcctcgcgtggatcacatgggtttgattgggtggggcctgatcacaagttgggttgaggtctgggcccactttaaactattctacgcgggccgccgttccacgtgtgctaatcatcgtcctaaccatgccccagcgaaaagatcgcgccgaccgacccacaccgcgccaccacttgccaccacgggcgtatcgagctgggctttcggatagaatataggagtatctacgctgcgcctgggcccagccgcgggcacgtcacccaccgggcggcgacgtcacactgccgccgtgggccccgcgcgcttttcgtcagtggatggtacaatctctatctgtctcgccaaaaggatctctgacccatccgccccgccgacgccgacgcgccgttgccttctctcccctcacctcccgacctcatcgccgcgatccccctccctccgcccggccccgaatccagcgcccggcccaggcgaccgcggccgatcgatctcctccggcgcgcggaaccggtgaaggcggcggcggcggcggtcgcgcgctcgattcggtgcgggtgccggctagggttcgctgccggcg。

8、本发明还提供了钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b的编码蛋白，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

9、seq id no.3：mnekrgleaaaagdgrpeakrsrppalasvivealkvdslqrlcssl epilrrvvseeveralgklgpaaitgrsspkriegpggrnlqlqfrtrlslplftggkvegeqgaaihvvlldtsngcvvssgpessakldivvlegdfnnedeegwteeefdshvvkeregkrpiitgdiqvtlkdgvgtigeftftdnsswirsrkfrlglkiasgfcqgvrireakteafmvkdhrgelykkhyppalkdevwrlekigkdgsfhkrlnksgiltvedflrlvvrdpqklrtilgsgmsnkmwdslvehaktcvlsgkyyiyysdehrtagaifndlyafcglisgeqfysseslddgqklfadglvkkaydnwmyvieydgkallnpkpkkkaaltsqpearapaayvqrisstsmpgpstagsngsigydgnqtatqsvqlqsssanvplpydeafsflpptmlmgsnqgtasdamglelsqlhhtisqahpiqpanvsydnwhhnrdsqyaddftedirmkshqllegedmqqllrvfnmggaspglpdetfsyqtympsplptpgfegepsrpsgkavvgwlkikaamrwgifvrkkaaerraqiveldd。

10、本发明还提供了包含权利要求1所述的钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b的crispr敲除重组载体，所述crispr敲除重组载体由编码基因hvcbp60b编码区域的19bp基因片段连入pub-cas9-tau6-sgrna载体构建得到。

11、本发明还提供了所述的钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b作为负调控因子在提高大麦耐盐性中的应用。

12、本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌中包含有编辑hvcbp60b钙调蛋白结合蛋白基因的crispr/cas9载体；所述hvcbp60b钙调蛋白结合蛋白基因的核苷酸序列为seq id no.1所示。

13、本发明还提供了所述的基因工程菌在调控大麦耐盐性中的应用。

14、钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b参与大麦耐盐性的调控，抑制该基因的表达可提高大麦的耐盐性。作为优选，所述大麦品种为大麦栽培品种golden promise。

15、进一步地，所述应用的途径为通过沉默hvcbp60b基因、敲除hvcbp60b基因或抑制hvcbp60b基因的表达获得突变体，从而提高大麦的耐盐性。

16、进一步地，敲除的手段为crispr/cas9基因编辑技术。

17、进一步地，所述的应用包括以下步骤：

18、(1)设计hvcbp60b基因的靶序列，构建crispr/cas9载体；

19、(2)构建含步骤(1)所述crispr/cas9载体的农杆菌基因工程菌；

20、(3)将步骤(2)所述基因工程菌转化大麦幼胚，获得不含外源cas9蛋白且稳定遗传的纯合单突变体株系。

21、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

22、(1)本发明首次克隆和分析了大麦中响应盐胁迫的钙调蛋白结合蛋白基因hvcbp60b，公布了该基因的核苷酸序列、氨基酸序列和启动子序列，对阐明大麦耐盐调控的分子机理和耐盐材料的培育具有重要意义。

23、(2)本发明首次通过基因编辑遗传转化手段，证实了hvcbp60b基因参与大麦耐盐性。其中敲除hvcbp60b基因后可显著增强大麦的耐盐性，有效缓减盐胁迫带来的不利影响，从而维持植株的正常生长。

24、(3)本发明指出钙调蛋白结合蛋白家族在植物中还存在多种分型，如能得到充分发掘和有效利用，将有利于改良大麦品种的耐盐性，同时亦可提高其他作物的抗逆性。